复合酶水解鲢鱼蛋白体系动力学模型探讨

王秀霞，王金，徐国念，万端极，*

（1.青岛农业大学 化学与药学院，山东 青岛 266109；2.湖北工业大学膜技术研究所，湖北 武汉 430068）

正如许多研究[1-3]认为，水解度是影响肽质量和产量的重要因素，水解度控制着肽段大小、游离氨基酸的相对含量。肽段过长，则具有生理活性的氨基酸残基未能断裂，就无法显现出相应的活性；水解过于完全，肽链进一步水解为游离氨基酸，则一些具有活性的短肽也被水解，从而导致活性明显降低。文献报道[4-5]，具有生物活性的肽段不仅与活性氨基酸的含量有关，还与氨基酸组成与序列有关，通常认为，具有活性的小分子肽比组成他们的游离氨基酸活性更高，因此在合适的水解时间终止酶解反应来控制水解度是非常有必要的。

目前对蛋白质酶解的动力学研究国内外均有报道，如Tello[6]研究了Protease660L、Alealase0.6L和PEM 2500s 3种酶水解乳清蛋白的动力学模型；Marquez[7]研究了以血红蛋白为底物的碱性蛋白酶催化水解的动力学模型；邓尚贵[8]等探讨了复合酶水解青鳞鱼水解动力学模型。本研究以产量最大且价格低廉的淡水白鳞鱼蛋白为酶解底物，采用Alcalase、Protamex双酶水解，在前人总结公式上进行水解度动力学模型探讨，验证了鲢鱼蛋白复合水解体系水解度模型参数，期望通过控制酶解过程来获得较强、较纯的生物活性肽，简化工业生产操作过程，降低后续分离纯化成本，为低值鱼深加工探索方向。

1 材料及方法

1.1 材料与试剂

氢氧化钠、Alcalase、Protamex：购于诺维信；白鲢鱼：市场购买，去头，搅碎。

1.2 主要仪器与设备

绞肉机：镇江市京口区食品机械厂；FA2000N型分析天平：上海名桥精密科学仪器有限公司；数显pH计：杭州奥立龙仪器有限公司；数显恒温水浴锅：上海嘉程仪器设备厂。

1.3 方法

用Alcalase、Protamex双酶水解鲢鱼蛋白，通过单因素确定最佳酶解条件为：温度55℃，pH7.5，底物质量分数w（底物蛋白）=4.5%，水解180 min。以复合酶用量分别为底物蛋白质量分数，即w（酶量）为:0.5%、1.0%、1.5%、2%、2.5%、3%加入水解体系，在反应过程中加入2 mol/L的NaOH溶液维持pH恒定，记录各个时间碱液用量，计算水解度（DH）。

水解度（DH）计算—pH-Stat法[9]

水解度定义为已水解的肽键数与原料中总肽键数的比值。

式中：B为碱液的体积，L；Nb为所用碱的浓度，mol/L；Mp为底物蛋白总量，g；α为氨基解离度，htot为原料中总肽键数，对于鱼蛋白htot=8.6 mmol/g[10]。其中氨基解离度的计算公式如下：

其中pH为酶解时pH，pKa的计算公式如下[11]：

T为水解时的开尔文温度。

2 结果与分析

根据前人[7]的研究有：

食物蛋白酶解均符合该公式。由公式（4）可以看出，水解度是一个关于反应时间的函数。对公式积分得：

式中：t为水解时间，min，此公式适用于所以蛋白质水解体系，对于不同的反应体系a、b值不同，而对于同一反应体系，a、b为常数。本研究以前面的试验条件来验证此动力学模型，结果如图1。

从图1中可以看出，各酶/底物蛋白质量分数下，水解度似乎与时间呈现某种非线性函数关系，为了验证公式（5）是否符合试验结果，以公式（5）为函数，分别对以上6组数据进行非线性对数拟合，拟合效果图见图2（a-f）。

从图2各个图的拟合结果可以看出，各加酶量下鲢鱼蛋白酶解体系的水解度实测值与公式（5）模型拟合的结果相当吻合，6个图均显著相关，因此可以认为鲢鱼蛋白双酶水解体系符合对数模型，即说明前面所建立的动力学模型既具有理论意义又有实际应用价值。为了确定公式（5）中a，b值分别代表什么，我们将上面6个对数拟合而计算出的a，b列于表1。

图1 不同酶质量分数的水解图Fig.1 Hydrolysis curves for different initial enzyme weight percentage

图2 不同酶／底物蛋白质量分数对数拟合图Fig.2 Logarithm curves fit of different initial enzyme weight percentage

表1 不同酶浓度水解动力学参数a与b值Table 1 The parameter a，b of enzyme kinetics of different concentration of enzyme

从表1的数据可以看出，b值各酶量下数值较接近，并不随酶量的改变而呈现某一规律变化，而a值则明显的随着酶量的增加而变大。

将加酶量与底物蛋白质量分数换算成加酶量与蛋白质量比值，结合表1可以得出结论，b值与加酶量无关，对于这一鲢鱼蛋白反应体系：复合酶Alcalase+Protamex，水解温度55 ℃，pH7.5，b值为常数，平均值为0.2351；将6个a值抽提出来，以e/s（%）为横坐标，a为纵坐标作图，并进行线性拟合，结果见图3。

图3 不同蛋白质量分数对数拟合图Fig.3 Logarithm curves fit of different protein concentrations

由图3可看出，a值与酶量/底物蛋白质量分数呈现显著的线性相关性，其线性关系式为：y=1.13415x-0.33791，即a值与e/s的关系式为：a=1.13415e/s-0.33791，b=0.2351，即水解度

为了验证水解度动力学模型实际指导意义，以e/s（%）为1.8、2.4，相同酶解温度和pH条件下试验，对比DH模型计算结果与实测值，结果见图4。

图4 实测水解度与理论水解度比较Fig.4 Comparison of experimental DH and calculated DH

由此可以认为：所建立的动力学模型具有实际指导价值，根据试验结果推导的鲢鱼蛋白复合酶水解体系的模型参数也是可信的。这对于工业生产实际操作具有指导意义，不用繁琐的记录加碱量来计算水解度，只要复合酶种类、底物浓度和温度不变，即可通过控制加酶量和水解时间来控制水解度以获得目标产物。

3 结论

在恒定水解温度与pH值条件下，通过试验验证，确定Alcalase、Protamex复合酶水解鲢鱼蛋白体系水解过程遵循DH=1/bln（1＋abt）这一动力学模型，经过数据拟合推算出模型参数a=1.134 e/s-0.3379，b=0.2351。验证试验表明，理论计算水解度与试验所测水解度基本吻合。

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