海南省胡椒瘟病病原鉴定及发生规律

桑利伟， 刘爱勤＊， 谭乐和， 曾会才， 孙世伟， 李继锋

（1．中国热带农业科学院香料饮料研究所，万宁 571533； 2．海南省热带香辛饮料作物遗传改良与品质调控重点实验室，万宁 571533； 3．中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）

胡椒是一种重要的热带香辛植物，原产于印度西高止山脉的热带雨林中，目前我国海南、广东、广西、云南、福建等省（区）均有种植。海南是中国胡椒的主产地。胡椒瘟病是一种气候依赖性病害，常在雨季时发生。它是由疫霉菌感染而引起的一种传染力很强的土传性病害［1］，自引种种植以来，胡椒瘟病就一直是危害我国胡椒生产的首要病害。叶片上的病斑是鉴定瘟病很重要的标志。植株下层的叶片最先感病，开始为浅褐色或灰黑色水渍状斑点，斑点迅速扩大成黑褐色、圆形或菱形病斑，边缘呈放射状扩展。病情严重的胡椒园能导致全园毁灭。

Muller于1936年首次记载并鉴定出胡椒瘟病的病原为棕榈疫霉胡椒变种（Phytophthor a pal mivora var．piperis）。其后，又相继有人报道了胡椒瘟病病原，并被归入棕榈疫霉（P．pal mivor a）中。由于其形态特征与其他种不同，作为一个新变异体，也称为Phytop hthor a pal mivor a （Butl．）Butler MF4；又因它与马来西亚的辣椒疫霉（Phytophthor a capsici）极其相似，因而又定名为辣椒疫霉［2－3］。国内仅张开明［4］等1991年对中国胡椒种植区胡椒瘟病病原菌进行了分离、鉴定，并证明辣椒疫霉和寄生疫霉为中国胡椒瘟病的主要病原菌。作者于2008年从海南省不同地区采集病样，对胡椒瘟病病原进行了分离、鉴定，并研究了该病的发生流行规律，以期为大田防治措施提供理论依据。

1 材料和方法

1．1 病原分离

从中国热带农业科学院香料饮料研究所基地（万宁市）、海南农垦国营东红农场（琼海市）、海南农垦国营东昌农场（海口市）采集胡椒瘟病病叶，剪取5 mm×5 mm大小病健交界处叶片，先于75%乙醇中浸8～10 s后，再于0．1%升汞溶液中消毒30 s，灭菌蒸馏水洗3～4次，用灭菌的滤纸吸干表面水分，接种于选择性V8培养基，配制方法参照郑小波［5］的方法。于室温下培养2 d，挑取菌落边缘生长旺盛的一块菌丝，转移至另一V8培养基上纯化，分别得到 HP1（东昌农场）、HP2（香饮所）、HP3（东红农场）3个菌株保存到试管斜面培养基备用。

1．2 病原鉴定

1．2．1 孢子囊的诱导产生和形态观察

将V8平板上长好的供试菌株菌落切成0．5 cm×0．5 cm小方块，移于灭菌水、过滤灭菌水中以刺激孢子囊的产生，待孢子囊大量产生后，用0．5%棉蓝乳酚油制片固定。描述菌落形态、镜检孢子囊形态，测量孢子囊大小及主菌丝直径并拍照［6］。

1．2．2 分离菌株的r DNA ITS测序分析

在形态鉴定的基础上，选取3个胡椒瘟病疫霉菌分离菌株提取DNA，采用通用引物P1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′和 P4：5′－TCCTCCGCTTATT GATATGC－3′对r DNA ITS1、5．8S及ITS2序列进行PCR扩增，PCR产物经电泳、凝胶回收、连接p MD18－T Vector（购自Ta Ka Ra公司）载体和转化E．coli DH5α感受态细胞后，对经鉴定为重组子的菌落培养液穿刺培养过夜，连同甘油保存管寄上海生工生物工程技术服务有限公司测序，将测得的序列去掉引物序列和载体序列后输入 www．ncbi．nl m．nih．gov进行Blastn分析，参照文献［7］的方法进行。

1．3 致病性测定

将3株供试菌株分别移于V8琼脂平板上培养10 d，然后在平板上加3～5 mL灭菌水刮平板，配制孢子囊悬浮液（浓度在300个／mL以上）。用孢子囊悬浮液室外喷雾接种1片胡椒叶表面，空白对照用无菌水喷雾接种胡椒叶表面，7 d后观察发病情况。此外，参试的疫霉菌株还有烟草疫霉（Phytophthor a nicotianae）2株（A1、A2交配型各1株）、棕榈疫霉（P．pal mivora）2株（A1、A2交配型各1株），均采取同样接种方法进行致病性测定。

1．4 发生规律观察

2008－2009年连续2年进行。方法是：在香饮所19号胡椒园内随机选取5个小区，每小区选10株，小区面积50 m2，共50株。每隔10 d调查1次，每月调查3次，计算每个月的平均发病率［8］。试验小区生长季节不进行药剂防治，水肥管理及农事操作正常进行。2008年和2009年的每月平均降雨量、平均温度及相对湿度等气象资料由万宁市气象局提供。运用SPSS软件，分别分析病害发生率同降雨量、温度及相对湿度等气象因子之间的相关性。

2 结果与分析

2．1 菌株形态特征

3株菌株的培养性状及形态特征一致，在V8培养基上生长较快，菌落白色，棉絮状或放射状，边缘较清晰（图1）。气生菌丝粗5～9μm，无隔膜，基生菌丝柔韧，未见膨大体，偶见厚垣孢子。在无菌水中，均可形成大量孢子囊，孢囊梗伞状分支或简单合轴分支；孢子囊形态、大小变异甚大，从近球形、肾形、梨形、椭圆形到不规则形，可见颗粒状内含物，大小为（50～110）μm×（25～60）μm，乳突明显，呈半球形，单个，偶见双乳突，排孢孔宽5～7μm；孢子囊易脱落，具长柄，柄长20～100μm（图2、图3）。其形态大小与已报道的辣椒疫霉相同。

图1 菌落形态

图2 孢子囊及其柄的形态大小

图3 孢子囊乳突及排孢孔

2．2 r DNA－ITS的序列分析

结果表明，去除引物结合区，所获得的3个菌株r DNA－ITS基因序列长度均为802 bp（Gen Bank登录号分别为FJ887797、FJ887798和FJ887799），包括18S核糖体RNA基因部分序列，ITSⅠ区、5．8S核糖体RNA基因和ITSⅡ区的完全序列，及28S核糖体RNA基因部分序列。将HP1、HP2和HP3菌株的核糖体DNA－ITS基因在Gen Bank中进行同源性比较，发现与其同源性最高的100个ITS序列菌株全部为疫霉属菌，HP1、HP2、HP3与它们的同源性为98%～100%，其中同源性最高的前11个菌株的序列一致性达99%以上（表1），且这11个菌株均为辣椒疫霉（Phytophthor a capsici），这进一步确认了形态鉴定的结果。用DNA MAN4．0进行序列比对，比对结果表明，菌株HP1、HP2和HP3的核糖体DNA－ITS序列同源性为99．83%，相对于 HP1菌株，HP2菌株在102位点处有一个碱基发生突变（C→T），HP3菌株在541、693和779位点处分别有一个碱基发生突变（C→T、G→A和G→T）。说明辣椒疫霉同种内的不同个体之间的ITS序列是非常保守的。所以，可根据辣椒疫霉与其他疫霉的ITS序列的变异较大区域设计引物，通过PCR方法检测胡椒瘟病。

图4 供试菌株r DNA－ITS基因的PCR扩增产物

表1 Gen Bank中与供试菌株r DNA－ITS序列同源性最高的11个菌株

2．3 致病性测定结果

进行致病性测定的3株供试菌株接种3 d后均表现典型的胡椒瘟病症状（图5），而空白对照和参试的烟草疫霉（Phytophthor a nicotianae）（A1、A2交配型各1株）、棕榈疫霉（P．pal mivor a）（A1、A2交配型各1株）接种1周后均未表现胡椒瘟病症状。从接种发病的病斑上分离的病原菌经灭菌水诱导产生大量的有乳突孢子囊，形态特征与接种菌株一致，说明3株供试菌株为胡椒瘟病的病原菌，而供试的烟草疫霉、棕榈疫霉不是胡椒瘟病的致病菌。

图5 致病性测定结果

2．4 发生规律

由表2、表3可知：该病一般从3月初开始发病，9－10月为发病高峰期；1－2月，由于气温低雨水少，基本不发病；3月上旬－5月中旬，平均气温在25～27℃，雨水较多，相对湿度较大，开始发病；5月下旬至8月下旬，由于持续的高温天气，雨水减少，发病逐渐减弱；9月上旬－11月上旬，由于平均气温回落到25～26℃，连续多雨，相对湿度大，这一时期胡椒瘟病发生危害最为严重；随后气温逐渐降低，雨量减少，发病减弱，12月上旬已基本不发病。2009年3月中旬至5月中旬，由于降雨量大，持续降雨天数多，也出现一个发病小高峰。这种情况在大多数年份几乎没有发生过。SPSS相关性分析结果表明：发病率与降雨量之间为显著正相关（R＝0．708～0．763，p＝0．004～0．01），降雨量越大，持续降雨天数越多，发病率越高。

表2 2008年气象因子与胡椒瘟病发生流行的关系1）

表3 2009年气象因子与胡椒瘟病发生流行的关系1）

3 讨论

本文首次根据形态特征和核糖体DNA－ITS的序列分析将海南胡椒瘟病的病原菌鉴定为辣椒疫霉（Phytophthor a capsici）。张开明等1991年对中国胡椒种植区胡椒瘟病病原菌进行了分离、鉴定，并证明辣椒疫霉和寄生疫霉为中国胡椒瘟病的主要病原菌。但本次鉴定的供试菌株没发现有寄生疫霉，可能是调查采样的范围不够广，供鉴定的不同地区来源的菌株还比较少。研究结果还表明，来自海南的胡椒瘟病菌与危害辣椒和番木瓜的辣椒疫霉菌株间存在极高的相似性，绝大部分菌株的ITS序列同源性为99%以上。

胡椒瘟病的发生流行与气象因子有极密切的关系。在气象因子中，降雨（特别是台风雨后连续降雨）是病害流行的主要因素。病害的发生和流行主要取决于当年的雨量。据海南省部分地区5个流行年的雨量的初步分析，每年流行季节的降雨量和当年发病有极密切的关系。年雨量在2 000 mm以上的植椒区，流行期9—10月（个别年份9—11月）两个月的总降雨量超过1 000 mm时，就可能局部发生和流行；如流行期两个月的总雨量超过1 000 mm，持续雨天在15 d以上，加上台风暴雨的影响，则可导致大面积瘟病流行。

［1］ Kueh Tiong－Kheng．Major diseases of black pepper and their management［J］．The Planter，1990，66：59－69．

［2］ Lee B S．Phytopht hor a—a serious plant pat hogen in Malaysia［J］．The Planter，1986，62（728）：493－494．

［3］ Brasier C M．Evol utionary biology of Phytophthor a［J］．Annual Review of Phytopat hology，1992，30：153－201．

［4］ 张开明，郑服丛，黎乙东，等．中国胡椒疫霉种及交配型的研究［J］．热带作物学报，1991，12（2）：71－76．

［5］ 郑小波．疫霉菌及其研究技术［M］．北京：中国农业出版社，1997．

［6］ 刘爱勤，曾涛，曾会才，等．海南香草兰疫病发生情况调查及疫霉菌种类鉴定［J］．热带作物学报，2008，29（6）：803－807．

［7］ Zeng H C，Ho H H，Zheng F C．Pythiu m vexans causing patch canker of r ubber trees on Hainan Island，China［J］．Mycopat hologia，2005，159（4）：601－606．

［8］ 方中达．植病研究方法［M］．第3版．北京：农业出版社，1998：37－155．