新型异噁唑啉类化合物的合成及其抗肿瘤活性

刘冰妮， 刘 默， 刘登科， 刘 巍， 祁浩飞

(1． 天津药物研究院 天津市分子设计与新药发现重点实验室，天津 300193；2． 天津工业大学 材料科学与工程学院，天津 300160)

异噁唑啉化合物因具有广泛的生物活性，如抗菌、抗炎、抗肿瘤[1～3]等而成为重要的医药中间体及先导化合物。对异噁唑啉类化合物的结构改造一直是该领域的研究热点之一[4]。

为寻找抗肿瘤药物提供筛选目标，本文在文献[1]方法的基础上，以3，4-二氟苯甲醛为起始原料，依次合成了3，4-二氟苯肟(1)， 3，4-二氟苯肟氯化物(2)，N-5-(乙酰胺甲基)-3-(3，4-二氟苯基)异噁唑啉(3)和N-【{3-[3-氟-4-(1-哌嗪基)苯基]-4，5-二氢-5-异噁唑}甲基】乙酰胺(4)等重要中间体。4与取代苯磺酰氯(5a～5f)经亲核取代反应合成了6个新型的异噁唑啉类化合物(6a～6f， Scheme 1)，其结构经1H NMR和MS表征。采用MTT法测试了6a～6f对骨肉瘤细胞(U2OS)和结肠癌细胞(HT-29)的抑菌活性，结果表明，6a～6f的IC50值均小于5-Fu,表明其具有较好的抑制U2OS和HT-29的作用，特别是6a,6c和6e表现出较强的抗肿瘤细胞的活性。

CompabcdefAr - HO2C- F3C- F- Cl- O2N-

Scheme1

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

Bruker AV400型核磁共振仪(DMSO为溶剂，TMS为内标)；LCQ AD MAX型质谱仪；Sunrise型酶联免疫检测仪。

3，4-二氟苯甲醛，工业品；N-烯丙基乙酰胺，自制；其余所用试剂均为分析纯；5-Fu注射液，天津金耀氨基酸有限公司；MTT, Amresco公司；DMEM培养基，Gibco公司；U2OS和HT-29，中科院上海细胞研究所。

1．2 合成

(1) 4的合成

在反应瓶中加入3,4-二氟苯甲醛20 g(140 mmol),盐酸羟胺12.8 g(180 mmol)和无水乙醇50 mL,搅拌使其溶解;加蒸馏水2 mL,缓慢滴加53%NaOH溶液25 mL,滴毕，于室温反应4 h。倾入冰水中析晶，过滤，滤饼干燥得白色固体1 18．5 g。

在反应瓶中加入1 18 g(110 mmol)的二氯甲烷(180 mL)溶液,搅拌下分批加入NCS 16.8 g(120 mmol)，加毕，回流反应2 h(TLC检测)。自然冷却至室温，加入N-烯丙基乙酰胺11 g(110 mmol)，冰水浴冷却至0 ℃，滴加三乙胺，滴毕，反应至终点(TLC检测)。用饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，减压蒸除溶剂，残余物干燥得淡黄色固体3 12 g,收率42.9%(以1计),m.p．138.6 ℃～139.2 ℃；1H NMRδ: 1.80(s, 3H), 3.05～3.48(m, 4H), 4.71～4.77(m, 1H), 7.47～7.73(m, 3H), 8.09～8.12(t,J=5.6 Hz, 1H)。

在反应瓶中加入3 12 g(47 mmol),无水哌嗪40.6 g(470 mmol)和碳酸钾8.4 g(60 mmol)，搅拌下于100 ℃～140 ℃反应5 h(TLC检测)。降至室温，加入适量二氯甲烷及蒸馏水搅拌，分液，有机层用水洗涤，无水Na2SO4干燥；减压蒸除溶剂，残余物干燥得白色固体4 14.1 g,收率93%， m.p.160.5 ℃～161.3 ℃；1H NMRδ: 1.79(s, 3H), 3.03(m, 1H), 3.10～3.19(m, 8H), 3.22(t,J=5.6 Hz, 2H), 3.40(m, 1H), 4.66～4.70(m, 1H), 7.33～7.54(m, 3H), 8.06～8.09(t,J=5.6 Hz, 1H)。

(2) 6的合成(以6a为例)

在反应瓶中加入4 2 g(6 mmol)的二氯甲烷(50 mL)溶液，搅拌下加入碳酸钾1.3 g(9 mmol)，冰水浴冷却至10 ℃，缓慢滴加对甲苯磺酰氯(5a)1.18 g(6 mol)的二氯甲烷(15 mL)溶液,滴毕，于室温反应2 h～3 h(TLC检测)。用蒸馏水洗涤，无水Na2SO4干燥，减压蒸除部分溶剂后于低温放置析晶，过滤，滤饼干燥得白色固体6a。用类似的方法合成白色固体6b～6f。

6a： 收率63%，纯度99.9%(HPLC，下同)，m.p.182.1 ℃～182.5 ℃；1H NMRδ: 1.79(s, 3H), 2.41(s, 3H), 3.01～3.40(m, 8H), 4.68～4.69(m, 1H), 7.03～7.66(m, 7H), 8.08(t,J=5.6 Hz, 1H)； MSm/z: 475.2{[M+H]+}。

6b： 收率49%，纯度99.1%， m.p.195.1 ℃～196.7 ℃；1H NMRδ: 1.81(s, 3H), 3.01～3.40(m, 12H), 4.68(m, 1H), 7.02～8.13(m, 7H), 8.20(t,J=5.2 Hz, 1H)； MSm/z: 505.2{[M+H]+}。

6c： 收率61%，纯度99.5%， m.p.155.9 ℃～156.4 ℃；1H NMRδ: 1.80(s, 3H), 3.02～3.41(m, 12H), 4.67(m, 1H), 7.05～7.99(m, 7H), 8.10(t,J=5.2 Hz,1H)； MSm/z: 529.3{[M+H]+}。

6d： 收率78%，纯度99.7%， m.p.141.6 ℃～142.3 ℃；1H NMRδ: 1.80(s, 3H), 3.03～3.42(m, 12H), 4.68(m, 1H)， 7.05～7.83(m, 7H), 8.08(t,J=5.2 Hz, 1H)； MSm/z: 479.1{[M+H]+}。

6e： 收率56%，纯度99.2%， m.p.206.2 ℃～207.1 ℃；1H NMRδ: 1.80(s,3H), 3.02～3.12(m, 12H), 4.67(m, 1H)， 6.99～7.64(m, 7H), 8.09(t,J=6.0 Hz, 1H)； MSm/z: 563.2{[M+H]+}。

6f： 收率57%，纯度99.4%， m.p.175.9 ℃～176.7 ℃；1H NMRδ: 1.79(s, 3H), 3.01～3.40(m, 8H), 4.66(m, 1H), 7.07～7.54(m, 7H), 8.06(t,J=5.6 Hz, 1H)； MSm/z: 506.5{[M+H]+}。

1．3 抗肿瘤活性测试

采用MTT法测试6对U2OS和HT-29的体外药效。以5-Fu为阳性对照药,6用DMSO助溶，再用无血清DMEM细胞培养基稀释到所需浓度待用。将对数生长期的肿瘤细胞以(6～10)×104个·mL-1的浓度接种于96孔板，每孔90 μL。在37 ℃, 100%相对湿度, 5%CO2和95%空气的培养箱培养24 h。每孔加10 μL药液，药液浓度为40．0 μg·mL-1, 20．0 μg·mL-1, 10．0 μg·mL-1, 5．0 μg·mL-1和2.5 μg·mL-1。各药物各浓度设6个复孔，并设空白组(不加细胞)和阴性对照组(加等浓度DMSO)，药物作用24 h后加5 mg·mL-1MTT溶液10 μL/孔，置培养箱培养4 h后加100 μL DMSO/孔，置酶标仪上于492 nm测OD值，计算细胞生长抑制率{抑制率/%=[1-(OD药液-OD空白)/(OD对照-OD空白)]×100%}，根据细胞生长抑制率，以直线回归方法计算IC50值。

2 结果与讨论

2.1 合成

在2的合成中，要控制好NCS分批加入的量和速度，以便控制反应液的温度。温度上升过快，易使溶剂剧烈沸腾，发生溢出。

合成3时反应的副产物较多，产率较低。本文对其工艺进行了优化，发现反应温度是最大的影响因素，并确定0 ℃和n(2) ∶n(N-烯丙基乙酰胺)=1 ∶1为最佳反应条件。

在4的合成中，无水哌嗪既是反应物料，又是溶剂，需过量加入，最佳投料比为：n(3) ∶n(无水哌嗪)=1 ∶10。

合成6时，考虑到5的活性较强，改变加料方式，采用缓慢滴加5的二氯甲烷溶液，避免了副反应的发生。后处理时保留部分溶剂使产物以结晶析出方式得到，纯度达99%以上。

2.2 抗肿瘤活性

6的抗肿瘤活性结果见表1。由表1可见，其IC50值均小于阳性对照药物5-Fu，表明6a～6f对U2OS和HT-29均有较好的抑制作用，特别是6a,6c和6e表现出较强的抑制U2OS和HT-29肿瘤细胞的活性。

表1 6的抗肿瘤活性Table 1 Anti-tumor activities of 6

[1] Barbachyn M R, Morris J, Wishka D G,etal． Substituted aminophenyl isoxazoline derivatives useful as antimicrobials[P].WO 9 941 244,1999．

[2] Cohan V L, Kleinman E F. Isoxazoline comounds as inhibitors of TNF release[P].US 6 114 367,2000.

[3] Li Q, Woods K W, Claibome A,etal. Synthesis and biological evaluation of 2-indolyloxazolines as a new class of tubulin polymerization inhibitors.Discovery of A-289099 as orally active antitumor agent[J].Bioorg Med Chem Lett,2002,12(3):465-469.

[4] Rakesh Sun D, Lee R B, Tangallapally R,etal. Synthesis,optimization and structure-activity relationships of 3,5-disubstituted isoxazolines as new anti-tuberculosis agents[J].Eur J Med Chem,2009,44(2):460-472.