黑莓果渣中花色苷的提取工艺研究

李 立，刘晔玮，岳 雄，李 丽，彭 倩，邸多隆

1兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生研究所;2中国科学院兰州化学物理研究所中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室;3兰州大学公共卫生学院流行病与卫生统计学研究所，兰州730000

黑莓果渣中花色苷的提取工艺研究

李 立1，2，刘晔玮1*，岳 雄3，李 丽1，2，彭 倩1，邸多隆2*

1兰州大学公共卫生学院营养与食品卫生研究所;2中国科学院兰州化学物理研究所中国科学院西北特色植物资源化学重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室;3兰州大学公共卫生学院流行病与卫生统计学研究所，兰州730000

通过提取方法优选，表明超声法对黑莓果渣中花色苷的提取效果最佳。以60%乙醇为超声法提取溶剂，通过单因素实验分别考察了料液比、超声时间、温度、功率、提取次数对提取黑莓果渣中花色苷的影响。综合单因素实验结果，通过响应面法筛选出最佳的工艺条件为:液料比14∶1(mL∶g)，时间40 min，温度58℃，功率300 W，提取2次。通过提取物中花色苷含量与其清除DPPH·活性的相关性分析发现，黑莓果渣提取物清除DPPH·活性与其花色苷含量之间存在相关性，由此推断花色苷为黑莓果渣中主要的自由基清除物质。

黑莓果渣;花色苷;提取;响应面法;自由基

黑莓(Blackberry)为蔷薇科悬钩子属植物，果实中含有丰富的花色苷类物质，是一种很好的天然食用色素，同时也是抗氧化剂和自由基清除剂的天然来源［1，2］。工业生产中一般榨其果汁主要用于制作甜点、果酱、果冻、果酒和饮料等［3］，而在榨汁加工中会产生大量的残渣，除黑莓籽可以用于榨油外，一般将果渣部分直接废弃，这不仅造成资源浪费，也会污染环境。因此，有必要对黑莓果渣中花色苷进行提取，这对于有效利用黑莓具有重要意义。赵慧芳等人以色价和含量为评价指标，通过传统的正交实验方法对黑莓果实中花色苷提取工艺进行筛选，确定了以1%HCl-甲醇为溶剂提取黑莓果实花色苷的最佳提取方法，同时证明黑莓果实色价和总花色苷含量具有极显著的正相关性［4］。但是，甲醇对于中枢神经系统、视神经及视网膜的毒性，做为提取溶剂提取天然产物中有效成分时，其溶剂残留一直是食品、保健品工业高度关注的问题。作者在前期的研究工作中，通过评价黑莓果渣不同极性溶剂提取物抗氧化活性，筛选出60%乙醇为提取黑莓果渣中抗氧化物质的最佳溶剂。响应面法已被广泛应用于优化天然产物中有效成分提取工艺条件的研究，响应面法可使各因素的交互作用通过有限次实验来评估，是一种优化加工条件的有效方法［5-7］。

本研究在前期研究工作基础上，通过单因素实验、响应面法筛选出最佳的工艺条件，并进一步探讨了黑莓果渣中抗氧化活性物质基础，为工业生产中更好地利用黑莓果渣提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

BT224S分析天平(Sartorius公司)，KQ-500DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，DZF-6050真空干燥箱(巩义市英峪予华仪器厂)，T6新世纪紫外-紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

1，1-二苯基-2-苦肼自由基(DPPH·)标准品(购自Sigma公司，批号:S43654-098)，双重蒸馏水(实验室自制)，乙醇、甲醇、浓盐酸、氯化钾、醋酸钠等均为分析纯。

黑莓果渣由南京新得力食品有限公司提供，低温避光保存，临用前取出，放至室温。

1.2 实验方法

1.2.1 花色苷含量测定方法［8，9］

取黑莓果渣提取物溶液，分别用pH 1.0和pH 4.5的缓冲溶液稀释后，以缓冲溶液作空白，在500～900 nm波长范围下进行吸收光谱扫描，确定最大吸收峰为510 nm，故选定510 nm和700 nm作为示差法测定黑莓果渣提取溶液中花色苷的吸收波长。

精密量取黑莓果渣提取物溶液各1 mL，分别用pH 1.0(0.2 mol/L KCl:0.2 mol/L HCl=25∶67(v/ v))和pH4.5(1 mol/L NaAc:1 mol/L HCl:H2O= 100∶60∶90(v/v))的缓冲液稀释并定容至10 mL，静置2 h后，分别在510 nm和700 nm处测定吸光值，总花色苷的含量(ACY)(以矢车菊色素-3-葡萄糖苷计)按下式(1)计算:

其中:V-提取液总体积(mL);m-取样量(g);

26900-矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数;

449.2 -矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔分子质量。

1.2.2 清除DPPH·活性测定［10］

DPPH·标准液制备:用甲醇配制浓度为0.054 mg/mL的DPPH·标准品储备液，临用时将储备液稀释至0.027 mg/mL的标准溶液。

精密量取样品溶液2 mL，加入2 mL DPPH·标准溶液，使总体积为4 mL，即为样品反应溶液。精密量取60%乙醇2 mL，加入DPPH·标准溶液2 mL，使总体积为4 mL，即为空样溶液。精密量取2 mL样品溶液，加入2 mL甲醇，使总体积为4 mL，即为空白溶液。分别将样品反应溶液、空样溶液和空白溶液混均后，在室温避光反应30 min后，在517 nm波长处测定吸光值，得到A样品、A空样和A空白。按下式(2)计算样品对DPPH·清除率。

1.2.3 提取方法考察

分别考察回流提取法、超声提取法、恒温循环提取法对黑莓果渣中花色苷的提取效果的影响，提取条件如下:

回流法:黑莓果渣2.00 g，加60%乙醇20 mL，回流提取1 h，过滤，滤液定容至200 mL，备用。

超声提取法:黑莓果渣2.00 g，加60%乙醇20 mL，超声提取1 h(140 W，40℃)，过滤，滤液定容至200 mL，备用。

恒温循环提取法:黑莓果渣2.00 g，加60%乙醇20 mL，恒温循环提取1 h(40℃)，过滤，滤液定容为200 mL，备用。

将上述提取液按照“1.2.1”测定方法测定提取液中花色苷含量。

1.2.4 单因素实验

以单因素实验分别考察超声温度(30～70℃)、超声时间(10～60 min)、超声功率(200～500 W)、超声次数(1～3次)和液料比［6∶1～22∶1(mL∶g)］等因素对黑莓果渣中花色苷提取效果的影响。

1.2.5 响应面法优化实验设计

根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，在单因素实验的基础上，选取超声温度、提取时间、超声功率进行3因素3水平响应面实验设计(见表1)，优化黑莓果渣花色苷提取条件。应用MiniTab计算机软件对所得数据进行多元回归拟合分析。

表1 响应面设计各因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.6 花色苷含量与清除自由基活性相关性分析

随机选取响应面实验设计提取的4个提取溶液，分别测定其花色苷含量和DPPH·清除活性，比较分析花色苷含量与清除自由基活性之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 最佳检测波长的选择

在花色苷分光光度法测定中，为了消除其它物质的干扰，根据花色苷在不同pH值环境结构发生变化，而干扰物质吸收光谱不随pH变化的特征，一般采取示差测定法。示差法是分别用两种不同pH值的缓冲溶液来稀释待测液，然后计算不同pH溶液吸光度差值的测定方法，通常选用的pH为1.0和4.5(光谱扫描如图1)。本实验选定510 nm和700 nm两个波长进行测定。

图1 黑莓花色苷在pH1.0和4.5缓冲液中吸收光谱Fig.1 Absorption spectrum of blackberry anthocyanins in pH1.0 and 4.5 buffer solution

2.2 不同提取方法花色苷含量比较

分别用回流提取法、超声提取法、恒温循环提取法提取黑莓果渣中花色苷，黑莓果渣中花色苷含量测定结果见表2。经方差分析:各处理组间均数差别存在统计学差异(P=0.000＜0.05)，超声辅助提取效果最佳。

2.3 单因素实验结果

2.3.1 温度对花色苷提取的影响

考察在液料比为10∶1，提取时间为30 min，功率为140 W的条件下，温度对60%乙醇提取黑莓果渣中花色苷的影响。由图2知:随着温度的升高，花色苷的提取率相应增加。当温度达到50℃时，花色苷提取率达到最大值，随后逐渐减低。这是因为升温能提高花色苷的溶解度和扩散速度，同时有助于细胞的破坏，从而使花色苷类物质易于从细胞内释出。但当温度超过某一热敏临界值时，反而会使花色苷降解，从而导致提取率降低［11］。

表2 不同方法提取黑莓果渣花色苷含量(mg/100 g)Table 2 The content of anthocyanins with different extraction methods(mg/100 g)

图2 温度对花色苷提取的影响Fig.2 Efect of the temperature on the total anthycanin content

2.3.2 液料比对花色苷提取的影响

考察在温度为40℃，提取时间为30 min，功率为140 W的条件下，液料比对60%乙醇提取黑莓果渣中花色苷的影响。由图3可知，在液料比在6∶1～22∶1(mL∶g)范围内，花色苷含量随着液料比的增加而增加。但当达到14∶1后其增加幅度放缓。从节约成本方面考虑，继续增加液料比会导致提取成本增加，故选择14∶1(mL∶g)作为最佳提取的料液比。

图3 液料比对花色苷提取的影响Fig.3 Efect of the ratio of solid to solvent on the total anthycanin content

2.3.3 提取时间对花色苷提取的影响

考察在液料比为10∶1，超声温度为50℃，功率140 W的条件下，提取时间对60%乙醇提取黑莓果渣中花色苷的影响。由图4可知，随提取时间的增加，花色苷的提取率相应增加。在30 min时，花色苷提取率达到最大值，而随着提取时间的继续增加，花色苷提取率变化不明显。

图4 提取时间对花色苷提取的影响Fig.4 Efect of the time on the total anthycanin content

2.3.4 超声功率对花色苷提取的影响

考察在液料比为10∶1，超声温度为50℃的条件下，提取时间为30 min的条件下，超声功率对60%乙醇提取黑莓果渣中花色苷的影响。由图5可知，随着超声功率的增加，花色苷的提取率相应增加。在达到300 W时，花色苷提取量达到最大值，随后逐渐减小。这可能是由于超声功率太大时，超声波强烈的机械振动使花色苷结构发生改变，从而对花色苷提取产生影响。因此超声提取黑莓果渣中花色苷其功率以300 W左右为宜。

图5 超声功率对花色苷提取的影响Fig.5 Effect of the ultrasonic power on the total anthycanin content

图6 提取次数对花色苷提取的影响Fig.6 Efect of the the number of extraction on the total anthycanin content

2.3.5 提取次数对花色苷提取的影响

在液料比为10∶1，超声温度为50℃的条件下，提取时间为30 min，功率为140 W条件下，考察提取黑莓果渣中花色苷的最佳次数。由图6可知，当提取2次时，花色苷提取率即已基本达到最大值，故提取次数以2次为宜。

2.4 响应面优化实验

2.4.1 结果及分析

利用软件DesignExpert 6.0中的Box-ehnken中心组合设计，对提取时间、提取温度和超声功率设计响应面实验，其结果见表3。

应用MiniTab计算机软件对表3所得数据进行多元回归拟合分析，拟合后得到得到关于时间(A)、温度(B)、超声功率(C)的二次多项式回归模型为:

对此回归模型进行方差分析(见表4)，结果表明，该模型极显著(P＜0.01)，回归模型调整确定系数R2=0.9591，矫正决定系数R2Adj=0.9066，说明回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可用此方程来分析和预测超声提取花色苷的工艺结果。

从表4的分析结果可知，超声提取温度影响极显著，而超声提取时间和提取功率影响不显著。在所选取的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序，超声提取温度＞提取时间＞超声功率。通过Design Expert数据处理软件得出花色苷含量最大值时各个因素组合，确定60%乙醇超声辅助提取黑莓果渣中花色苷的最佳参数为:时间40 min，温度57.45℃，功率300.87 W，此条件下提取花色苷含量为1395.99 mg/100 g。考虑到实际操作的便利，将最佳的黑莓果渣花色苷提取工艺修正为:时间40 min，温度58℃，功率300 W。

表4 花色苷提取参数数学回归分析结果Table 4 Variance analysis of items of regression equation

根据回归分析结果，可得到相应的曲面图，如图 7～图9示。

图7 提出时间和温度对提取花色苷量的影响Fig.7 Interaction of temperature and time on the total anthycanin content

由图7可知:随着提取温度的增加，花色苷提取含量相应增加，但温度超过一定值时，花色苷含量反而略有下降。随提取时间的增加，花色苷含量略有增加，但其对花色苷含量的影响相对不太明显。从其等高线图可以看出此两因素的交互作用显著。

由图8可以看出，当超声功率较低时，花色苷含量随超声功率的增加而增加，但当超声功率超过一定值时，花色苷含量又随之降低。提取时间对花色苷含量影响相对不明显。从其等高线图可以看出此两因素的交互作用不显著。

由图9可以看出，随着温度的增加，花色苷含量随之增加，但当温度达到一定值后，花色苷含量略有下降;功率对花色苷含量的影响相对不太明显。从其等高线图可以看出此两因素的交互作用不显著。

2.4.2 优化工艺的验证

采用修正后的响应面提取条件进行三次平行实验，结果花色苷含量平均值为1379.33 mg/100g，比响应面最佳条件下花色苷含量降低了1.2%，但差异不大，故本实验选择修正后的响应面最佳条件作为优化结果。

2.5 花色苷含量与清除自由基活性相关性分析

对不同条件下提取的溶液对应黑莓果渣花色苷含量与清除DPPH·活性进行相关性分析，结果表明:黑莓果渣提取物花色苷含量与清除DPPH·呈正的直线相关(相关系数为0.992，P=0.001＜0.05)。由此可以初步推断黑莓果渣中花色苷为其主要抗氧化活性物质(见表5)。

表5 不同条件提取黑莓果渣花色苷含量与对应提取溶液清除自由基活性Table 5 The content of anthocyanins and free radical scavenging activity of different sample solution

3 结论

通过提取方法优选，表明超声法对黑莓果渣中花色苷的提取效果最佳。以60%乙醇为超声法提取溶剂，通过单因素实验和响应面回归分析法筛选提取黑莓果渣中花色苷最佳工艺条件为:时间40 min、温度58℃、功率300 W、液料比14∶1(mL∶g)、提取2次。

黑莓果渣提取物对应花色苷含量与清除DPPH·活性之间呈正的直线相关，由此可以初步推断黑莓果渣中花色苷为其主要清除自由基活性物质。

1 Wu WL(吴文龙)，Gu Y(顾姻).Blackberry introduction and cultivation.J Plant Resour Environ(植物资源与环境学报)，1994，3:45-48.

2Wu WL(吴文龙)，Li WL(李维林)，Lv LF(闾连飞)，et al.Comparison of nutrient constituents in fresh fruit of different cultivars of blackberry.J Plant Resour Environ(植物资源与环境学报)，2007，16:58-61.

3Qian H(钱骅)，Zhang WM(张卫明)，Zhao BT(赵伯涛)，et al.Study on processing technology of fruit and vegetable beverage of blackberry.Food Sci Technol(食品科技)，2006，9:186-189.

4Zhao HF(赵慧芳)，Wang XM(王小敏)，Lv L(闾连)，et al.Study on the extraction and assay method of anthocyanin in blackberry fruits.Sci Technol Food Ind(食品工业科技)，2008，29:176-179.

5 Shi Y(石岳)，Zhang XL(张秀玲)，Zou Y(邹阳).Response surface methodology＆its application in food industry.Sci Technol Food Ind(食品工业科技)，2007，12:56-57.

6 Kalaimahan T，Tapobrata P.Application of response surface methodology to evaluate the influence of temperature and initial pH on the production of β-1，3-glucanase and carboxymethy-cellulase from Trichoderma harzianum.Enzyme Microb Technol，1995，17:1043-1049.

7 Ingrid E，Chun H，David GP，et al.Antioxidant assessment of an anthocyanin enriched blackberry extract.Food Chem，2007，101:1052-1058.

8 Subramani S，Casimir CA，Gerard K.Phenolic compounds and antioxidant capacity of georgia-grown blueberries and blackberies.J Agric Food Chem，2002，50:2432-2438.

9 Chen XX(陈欣欣)，Xu SY(许时婴).Extraction of anthocyanins and polyphenols from blackberry juice-processing waste.Sci Technol Food Ind(食品工业科技)，2006，26: 135-139.

10 Ma QY(马庆一)Xu SY(许时婴)，Xiong WD(熊卫东)，et al.Study on the free radical scavenging active components in sweet potato stems.Food Sci(食品科学)，2003，24:145-148.

11 He L(何玲)，Tang AJ(唐爱均)，Hong F(洪峰).Study on the property of red grape red pigment.J Northwest Sci-tech Univ Agric For，Nat Sci(西北农林科技大学学报，自科版)，2005，33:73-76.

Extraction Method of Anthocyanin in Blackberry Pomaces

LI Li1，2，LIU Ye-wei1*，YUE Xiong3，LI Li1，2，PENG Qian1，DI Duo-long2*1Institute of Nutrition and Food Hygiene，of Public Health，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China;2Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province，Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China;3Institute of Epidemiology and Health Statistics，of Public Health，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

The anthocyanin in the blackberry pomaces was extracted with the different metheods，and the results showed that the anthocyanin content of rasound-assisted extraction was the highest.The 60%ethanol was used to extract anthocyanin with ultrasonic assisted extraction and ratio of liquid to materia，ultrasoni time，extraction temperature，ultrasonic power，and extraction times were assessed in single-factors experiment.On the basis of single-factor test，the optimum conditions for the ultrasound assisted extraction of anthocyanin from blackberry pomaces were determined as follows using response surface method(RSM):the liquid-olid atio(mL∶g)14∶1，extraction time 40 min，extraction temperature 58℃，ultrasonic wave power 300 W，and two step extraction.The correlation analysis results showed that the anthocyanin content and DPPH·scavenging activity had significant correlation，and inferenced that anthocyanin was the main free radical scavenging substances.

blackberry pomaces;anthocyanin;extraction;response surface methodology;radical

1001-6880(2011)05-0939-07

2010-05-28 接受日期:2010-07-29

甘肃省自然科学基金(096RJZA058);中国科学院“百人计划”择优项目(O651301051)

*通讯作者 Tel:86-013519446679;E-mail:liuyw@lzu.edu.cn

R284.2;TS201.1

A