甲氧补骨脂素对大鼠成骨细胞生物活性影响的实验研究

张红莲，郑 龙，边艳珠，张军芳，王建华*

1河北医科大学药学院，石家庄050017;2河北省人民医院核医学科，石家庄050051; 3河北省实验动物重点实验室，石家庄050017

甲氧补骨脂素对大鼠成骨细胞生物活性影响的实验研究

张红莲1，郑 龙3，边艳珠2，张军芳1，王建华1*

1河北医科大学药学院，石家庄050017;2河北省人民医院核医学科，石家庄050051;3河北省实验动物重点实验室，石家庄050017

为探讨甲氧补骨脂素对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞增殖与分化作用的影响，用改良的组织块培养法分离培养新生大鼠颅骨成骨细胞，在成骨细胞体系中以不同浓度加入甲氧补骨脂素，MTT法检测加药后不同时间细胞的增殖情况;用对硝基苯二钠基质动力学法(PNPP)测定细胞内碱性磷酸酶的活性，用改良的Lowry法测蛋白含量;用放射免疫法测定细胞内骨钙素含量。结果显示:与对照组相比，甲氧补骨脂素组在24 h和36 h时促进体外大鼠成骨细胞增殖的作用更明显;在24、48 h和72 h时均能提高成骨细胞碱性磷酸酶活性(ALP)和骨钙素(BGP)的分泌。甲氧补骨脂素对体外培养的大鼠成骨细胞的增殖与分化均有明显的促进作用。

成骨细胞;细胞增殖;细胞分化;骨钙素;甲氧补骨脂素

补骨脂性温，味辛微苦，归肾、脾经，具温补肾阳之功效。含补骨脂素(psoralen)、异补骨脂素(isopsoralen)、甲氧补骨脂素(methoxypsoralen)等呋喃香豆素类化合物。香豆素类化合物为植物雌激素之一。有研究表明甲氧补骨脂素联合长波紫外线(UVA)有促进大鼠成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性的作用［1］。前文［2］报道了补骨脂素对大鼠成骨细胞增殖和碱性磷酸酶活性有明显促进作用，本文继续探讨甲氧补骨脂素对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响，对进一步研究补骨脂香豆素类植物雌激素防治骨质疏松的作用及中药新药开发有一定的意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物

出生24 h内SD系乳大鼠:性别体重不限。河北省实验动物中心提供，动物合格证号:810010。

1.2 试剂与仪器

DMEM培养基(GIBCO);胎牛血清(北京燕生生物技术有限公司);Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司);碱性磷酸酶试剂盒(保定长城试剂有限公司，批号: 20090422);甲氧补骨脂素(8-Methoxypsoralen)(上海融禾生物制品有限公司，含量 98%，批号: 080707);骨钙素放免试剂盒(天津协和医药科技有限公司，批号:200907);XDS-1B型倒置相差显微镜(OLYMPUS);二氧化碳培养箱(美国NATURE公司);TECAN酶标仪(奥地利);XH-6020型γ-放射免疫计数器(国营西安二六二厂)。

1.3 新生大鼠颅骨成骨细胞的培养及鉴定

无菌条件下，取出生后24 h以内的大鼠乳鼠颅盖骨，用平衡盐溶液PBS冲洗数次，放入0.25%的胰蛋白酶溶液中，剔除骨表面被膜及软组织，将骨片剪成1～3 mm3的骨粒，弃去胰蛋白酶溶液。在0.1%胶原酶Ⅱ中室温消化45 min，将消化液弃去，平衡盐溶液PBS洗三遍。将骨粒分散于100 mL培养瓶中，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，37℃5%CO2培养箱中培养。5 d后，将骨粒弃去，细胞进行传代培养，将细胞用胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培养基吹打传代，置于细胞培养瓶中放入培养箱中继续培养。

细胞传至第5代，通过细胞形态学观察及碱性磷酸酶细胞化学染色鉴定所用细胞为成骨细胞［3］。细胞纯度超过90%以上。

1.4 MTT法测细胞生长曲线

取传至第5代培养的细胞，用0.25%的胰酶消化，制成1×104个/ml的DMEM细胞悬液，然后在96孔板的各孔内准确接种相同数量的细胞。分别在培养1，2，3，4，5，6 d后，每天取8个孔，每孔加入MTT 20 μL，于37℃，5%CO2培养箱中继续孵育4 h，吸弃培养基后加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，10 min后用酶标仪测定492 nm吸光度。最后用Microsoft Excel XP软件绘制细胞生长曲线。

1.5 成骨细胞增殖实验的测定

将成骨细胞按2×104/mL密度接种于96孔板，待细胞70%融合后，换加含不同浓度的甲氧补骨脂素(10-9～10-5mol/L)的无血清培养基，分别在培养12 h，24 h，36 h后，每孔加入MTT 20 μL，于37℃，5%CO2培养箱中继续孵育4 h，吸弃培养基后加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，10 min后用酶标仪测定492 nm吸光度。

1.6 成骨细胞分化实验的测定

将成骨细胞按2×104/mL密度接种于24孔板，待细胞70%融合后，换加含不同浓度的甲氧补骨脂素(10-9～10-5mol/L)的无血清培养基，培养24，48，72 h后，分别将两块24孔板取出，吸取培养基用于骨钙素测定。细胞用PBS冲洗3次后，每孔加入250 μL 0.1%TritonX100溶液，吹打细胞，10 min后，收集每孔的溶液，用于碱性磷酸酶及蛋白质的测定。碱性磷酸酶(ALP)测定采用对硝基苯磷酸二钠基质动力学法，并用Lowry法进行蛋白质含量测定，结果用蛋白含量校正，以每克蛋白中碱性磷酸酶国际单位(U/mg protein)表示。骨钙素测定采用放射免疫法(RIA)，按试剂盒说明进行，以ng/mL表示。

1.7 统计学分析方法

采用SPSS13.0统计软件分析，实验结果以均数加减标准差(±s)表示。组间差异比较用单因素方差分析(ANOVA)。

2 结果

2.1 MTT法绘制生长曲线

接种后的第1 d开始，倒置显微镜下观察，细胞数量扩增较慢，为细胞生长适应期，以后细胞增长加速，第5 d达到高峰，以后增长速度逐渐减慢，见图1。

2.2 甲氧补骨脂素对成骨细胞增殖的影响

大鼠成骨细胞在含不同浓度甲氧补骨脂素(10-9～10-5mol/L)培养基中培养12 h，浓度为10-6mol/L和10-5mol/L与空白组比较有促增殖作用(P＜0.05);培养24 h，与空白组比较，各个浓度均有促增殖作用，其中10-5mol/L，10-8mol/L，10-9mol/L作用较为明显(P＜0.01);培养36 h，各个浓度与空白组比较均有显著的促增殖作用(P＜0.01)，见表1。

2.3 甲氧补骨脂素对成骨细胞分化的影响

2.3.1 对碱性磷酸酶活性的影响

碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期标志［4］。大鼠成骨细胞在含不同浓度甲氧补骨脂素(10-9～10-5mol/L)培养基中培养24 h，与空白组比较，浓度为10-7、10-8和10-9mol/L的甲氧补骨脂素可以提高成骨细胞碱性磷酸酶的活性，促进成骨细胞的分化。培养48 h，浓度为10-7、10-8、10-9mol/L促进碱性磷酸酶活性的作用，其中10-9mol/L作用较为显著(P＜0.01)。培养72 h，与空白组比较，浓度为10-7、10-8、10-9mol/L有促进碱性磷酸酶活性的作用(P＜ 0.05)，见表2。

2.3.2 对骨钙素水平的影响

骨钙素是成骨细胞分化的晚期标志［3］。大鼠成骨细胞在不同浓度的甲氧补骨脂素存在下培养24 h，1×10-7、1×10-8mol/L和1×10-9mol/L可提高大鼠成骨细胞骨钙素的表达水平，培养48 h后，1× 10-8mol/L继续保持高表达水平，提高成骨细胞骨钙素的表达;培养72 h后，仅1×10-9mol/L促进大鼠成骨细胞骨钙素的分泌，见表3。

图1 MTT法测大鼠成骨细胞生长曲线Fig.1 Growth curve of rat osteoblast cells by MTT

表1 甲氧补骨脂素对大鼠成骨细胞增殖的影响(吸光度A，n=10，±s)Table 1 Effect of 8-methoxypsoralen on the proliferation of osteoblast(A，n=10，±s)

表1 甲氧补骨脂素对大鼠成骨细胞增殖的影响(吸光度A，n=10，±s)Table 1 Effect of 8-methoxypsoralen on the proliferation of osteoblast(A，n=10，±s)

注:不同浓度甲氧补骨脂素组与空白对照组相比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01，下同。Note:Group of 8-methoxypsoralen with different concentrations compared with blank.*P＜0.05，＊＊P＜0.01.The same as follow.

浓度Concentration (mol/L)甲氧补骨脂素8-methoxypsoralen培养时间Period of incubation(h) 12 24 36 0 0.315±0.046 0.276±0.019 0.231±0.024 1×10-5 0.348±0.024* 0.319±0.023＊＊ 0.321±0.026＊＊1×10-6 0.352±0.033* 0.296±0.017* 0.283±0.018＊＊1×10-7 0.324±0.031 0.297±0.019* 0.273±0.026＊＊1×10-8 0.316±0.043 0.310±0.026＊＊ 0.313±0.033＊＊1×10-9 0.323±0.034 0.313±0.017＊＊ 0.325±0.023＊＊

表2 甲氧补骨脂素对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响(U/mg，n=8，±s)Table 2 Effect of 8-methoxypsoralen on the ALP activity of osteoblast(U/mg，n=8，±s)

表2 甲氧补骨脂素对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响(U/mg，n=8，±s)Table 2 Effect of 8-methoxypsoralen on the ALP activity of osteoblast(U/mg，n=8，±s)

浓度Concentration (mol/L)甲氧补骨脂素8-methoxypsoralen培养时间Period of incubation(h) 24 48 72 0 0.709±0.144 1.197±0.366 1.788±0.186 1×10-5 0.837±0.207 1.576±0.457 1.730±0.277 1×10-6 0.823±0.082 1.370±0.396 1.599±0.293 1×10-7 0.923±0.082* 1.805±0.779* 2.226±0.358* 1×10-8 1.379±0.155＊＊1.849±0.453* 2.242±0.369* 1×10-9 1.332±0.252＊＊2.200±0.340＊＊2.258±0.712 *

表3 甲氧补骨脂素对大鼠成骨细胞分泌骨钙素的影响(ng/mL，n=8，±s)Table 3 Effect of 8-Methoxypsoralen on the osteocalcin secretion of osteoblast(ng/mL，n=8，±s)

表3 甲氧补骨脂素对大鼠成骨细胞分泌骨钙素的影响(ng/mL，n=8，±s)Table 3 Effect of 8-Methoxypsoralen on the osteocalcin secretion of osteoblast(ng/mL，n=8，±s)

浓度Concentration (mol/L)甲氧补骨脂素8-methoxypsoralen培养时间Period of incubation(h) 24 48 72 0 0.162±0.075 1.222±0.293 1.084±0.532 1×10-5 0.621±0.390 1.430±0.429 1.024±0.337 1×10-6 0.385±0.142 1.260±0.420 1.397±0.417 1×10-7 0.868±0.457* 1.215±0.330 1.416±0.268 1×10-8 1.338±0.941＊＊1.851±0.394* 1.466±0.361 1×10-9 1.541±0.227＊＊1.478±0.254 2.065±0.684*

3 讨论

成骨细胞是参与骨代谢的重要细胞，对骨组织的生长发育、损伤修复、骨代谢平衡和骨量维持起关键作用，它与破骨细胞共同维持着骨代谢的平衡。成骨细胞的主要功能为合成分泌碱性磷酸酶和合成骨钙素等非胶原蛋白，并诱导基质矿化，直接参与骨形成。一旦成骨细胞衰老，其生成不足和功能降低，将直接导致骨形成减少，引起骨质疏松的发生。

补骨脂为豆科植物补骨脂 Psoralea corylifolia L.的成熟果实，具有温补肾阳之功效。中医认为，肾主骨生髓。研究表明，许多补肾中药具有防治骨质疏松的作用［6］。有实验显示用含不同浓度补骨脂注射液的DMEM培养成骨细胞，发现补骨脂对新生大鼠成骨细胞的增殖有显著促进作用［7］。本实验探讨了甲氧补骨脂素对大鼠成骨细胞增殖分化的影响，结果显示，甲氧补骨脂素具有促进大鼠成骨细胞增殖分化的作用。甲氧补骨脂素组在24 h和36 h时促进体外大鼠成骨细胞增殖的作用更明显;在24 h、48 h和72 h时均能促进成骨细胞碱性磷酸酶活性(ALP)和骨钙素(BGP)的分泌。甲氧补骨脂素对成骨细胞除刺激增殖外，对ALP活性和骨钙素的分泌均有较好刺激作用，说明甲氧补骨脂素在促进细胞增殖的同时，也能促进细胞进一步分化成熟。因而可提高成骨细胞骨形成的功能，为骨质疏松症防治提供了一条途径。

本实验结果是甲氧补骨脂素对体外培养成骨细胞的直接作用，其作用机理尚待深入探讨。此外，人体是一个复杂的环境，骨代谢受多种激素和因子的影响，甲氧补骨脂素对整体防治骨质疏松的作用有待于骨质疏松动物模型的影响实验来进一步验证。

1 Mainlin GI，Hornicek FJ，Banovac K，et al.Interaction of cultured rat osteoblasts with 8-methoxypsoralen during irradiation with long-wave ultraviolet light.Biochem Biophys Res Commun，1995，207;877-881.

2Wang JH(王建华)，Wang Y(王艳)，Pan YM(潘永梅).Effects of psoralen on proliferation and differentiation of cultured osteoblasts in vitro.Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发)，2007，19;844-846.

3 Situ ZQ(司徒镇强)，Wu JZ(吴军正).Cell Culture(细胞培养).Xi'an:World Book Publishing Company，2004.160-164.

4Jin WF(金慰芳)，Zhu WG(朱文管)，Wang HF(王洪复)，et al.Effects of HU-ECS on proliferation，differentiation and mineralization of cultured osteoblasts in vitro.Chin J Osteop (中国骨质疏松志)，2001，7:9-11.

5 Li E(李恩)，Kong DJ(孔德娟)，Yang XH(杨学辉)，et al.Effects of kidney-tonifying chinese medicinal herbs on prevention of rat osteoporosis.Chin J Osteoporos(中国骨质疏松志)，2002，8:166-170.

6 Lin JZ(林举择)，Chen SK(陈升恺)，Luo JD(罗家栋).The proliferatinve effect of psoralea injection on in-vitro-cultivated rat osteoblasts.J Tradit Chin Orthop Traumatol(中医正骨)，2004，6:326-328.

Effects of 8-Methoxypsoralen on Proliferation and Differentiation of Cultured Osteoblasts in vitro

ZHANG Hong-lian1，ZHENG Long3，BIAN Yan-zhu2，ZHANG Jun-fang1，WANG Jian-hua1*1Faculty of Pharmacy，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China;2Isatopic Laboratory，Hebei Provincial People's Hospital，Shijiazhuang 050051，China;3Hebei Key Lab of Laboratory Animal Science，Shijiazhuang 050017，China

To study the effects of 8-methoxypsoralen on proliferation and differentiation of cultured osteoblasts in vitro，MTT，PNPP and RIA were used separately to observe the proliferation，the activity of ALP and the content of osteocalcin of osteoblasts cultured in vitro with 8-methoxypsoralen of different concentration in it for different incubation periods.Protein was measured by Lowry.The effects of promoting proliferation of rat osteoblasts cells in vitro after 24 h and 36 h were more marked by the groups of 8-methoxypsoralen compared with the control group.The activity of alkaline phosphate(ALP)and secretion of osteocalcin(BGP)were stimulated by 8-methoxypsoralen after 24，48 h and 72 h incubation.It was demonstrated that 8-methoxypsoralen has the effects on stimulating the proliferation and differentiation of cultured osteoblasts in vitro.

osteoblast;proliferation;differentiation;osteocalcin;8-methoxypsoralen

1001-6880(2011)05-0927-04

2009-08-11 接受日期:2010-04-27

河北省自然科学基金资助项目(C2009001072)，河北省科学技术研究与发展计划项目(河北省科技支撑计划项目 09276418D-14)，河北省中医药管理局课题(2007116)

*通讯作者 E-mail:smith_wang2000@126.com

R285.5

A