免疫蛋白酶体亚基在干燥综合征唇腺中的表达

李 珍，罗玉凤，曹金伶，郭春岚，王鸿琳，肖镜琏，张 洁，张 丁

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 1口腔科 2病理科，北京100730

·论著·

免疫蛋白酶体亚基在干燥综合征唇腺中的表达

李 珍1，罗玉凤2，曹金伶2，郭春岚1，王鸿琳1，肖镜琏1，张 洁1，张 丁1

中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院1口腔科2病理科，北京100730

目的观察免疫蛋白酶体亚基人低分子质量多肽(LMP) 2、LMP7在干燥综合征(pSS)患者唇腺中的表达情况, 探讨其在pSS诊断、鉴别诊断和发病机制中的作用。方法收集40例pSS患者、15例非pSS的结缔组织病患者和9例正常人的下唇唇腺组织标本，通过免疫组织化学方法, 观察LMP2和LMP7在3组唇腺组织中的表达情况; 计算腺泡阳性率，半定量分析LMP2和LMP7在各组唇腺组织中的表达强度。对数据进行平方根反正弦转换后，采用单因素方差分析比较3组间的LMP2和LMP7的腺泡阳性率差异，用Spearman进行pSS组的腺泡阳性率与各临床检查结果的相关性分析。结果LMP2和LMP7表达在腺泡细胞和导管上皮细胞。LMP2的腺泡阳性率3组间差异无统计学意义(P=0.369)，LMP7的腺泡阳性率3组间差异均有统计学意义(P<0.01)，pSS组高于结缔组织病组，结缔组织病组高于正常组；仅pSS组内的LMP7的腺泡阳性率高于LMP2(P<0.01)。pSS组内LMP2和LMP7腺泡阳性率与临床各检验结果无相关性(P>0.05)。结论pSS患者唇腺中LMP7的表达明显增强，LMP2无明显上调，提示LMP7和LMP2两亚基的个体基因调节机制不同。

干燥综合征；蛋白酶体；涎腺

干燥综合征(primary Sjögren’s syndrome，pSS) 又称原发性舍格伦综合征，是一种自身免疫介导的慢性炎性疾病，以外分泌腺，尤其是唾液腺和泪腺的进行性破坏为特点。其主要病理变化发生在腺实质细胞和胞外基质中，致使腺泡萎缩、导管破坏，造成腺体功能紊乱，出现口、眼干燥等症状和体征[1]。蛋白酶体普遍存在于真核细胞胞浆内。蛋白酶体亚基在pSS患者体内表达发生变化，最初的证据是在pSS患者血清中分离出蛋白酶体α和β亚基的自身抗体[2]。虽然自身抗体的存在并不一定意味着靶抗原在病变过程中受累及，但可以代表一个附属表征，循环蛋白酶体成分的出现可能是细胞破坏和自身免疫病中免疫活性的标志[3]。近年研究显示pSS患者唇腺组织内免疫蛋白酶体β亚基中人低分子质量多肽(low molecular weight polypeptide、LMP)2、复合催化蛋白酶样蛋白1(multicatalytic endopeptidase complex-like 1、MECL-1)和LMP7的mRNA表达上调[4-6]。但在蛋白水平上，组织学和血清中均显示LMP2表达下调[5,7]，LMP7表达有争议(无差异[5]或特异性上调[6])，因而学者提出蛋白酶体在pSS患者体内可能表达失调。蛋白酶体途径的失调和异常是促使恶性肿瘤、退行性、代谢性和自身免疫性疾病形成的发病机制。本研究拟通过免疫组织化学方法观察LMP2、LMP7在pSS患者、有口干症状的非干燥综合征的结缔组织病患者和正常人唇腺组织中的表达情况，探讨其在疾病诊断、鉴别诊断及发生机制中的作用。

对象和方法

对象全部患者均为就诊于北京协和医院风湿免疫科及口腔科门诊或住院患者，自2010年1至6月于北京协和医院口腔科门诊接受唇腺活检。pSS组40例，其中女性38例、男性2例，平均年龄(46±11)岁，诊断均符合2002年pSS国际分类(诊断)标准[8]；非pSS的结缔组织病(connective tissue disease, CTD)组15例，其中女性14例、男性1例，平均年龄(49±14)岁，包括类风湿关节炎7例、系统性红斑狼疮4例、原发性胆汁性肝硬化3例；正常组9例，来源于唇外伤(6例)或唇黏液腺囊肿(3例)周围正常的唇腺组织，其中女性5例、男性4例，平均年龄(49±20)岁。

免疫组织化学方法将64例石蜡包埋的唇腺切片脱蜡、梯度复水后，进行高压法抗原修复，用Bio-mol公司的兔抗人LMP2和LMP7亲合纯化多克隆抗体(BML-PW8345和BML-PW8355，1∶1 000的稀释度)，显色剂选用Dako公司的K3468，采用Envision两步法免疫组织化学试剂盒进行免疫组织化学染色。覆盖切片的病理号及分组信息(原始编码)，重新进行随机编码(二次编码)，在每张切片上随机选取100个腺泡，设定腺泡腔面棕色颗粒沉积面积超过腺泡腔、细胞膜总面积50%者为阳性腺泡，重复读数4次，取平均值，计算每张切片的腺泡阳性率。待获得所有读片结果后，再对照二次编码和原始编码，对LMP2和LMP7蛋白的表达进行分组分析，从而对pSS组、CTD组和正常组唇腺总蛋白中LMP2和LMP7的表达水平进行半定量分析。并根据2002年pSS分类(诊断)标准(根据每4 mm2涎腺组织中有多于50个淋巴细胞的聚集记为一个灶，制定分级标准：0级：无淋巴细胞浸润；Ⅰ级：轻度浸润；Ⅱ级：中度浸润；Ⅲ级：一个灶；Ⅳ级：一个灶以上。病理改变为Ⅲ或Ⅳ级则为阳性)[8]将pSS组、CTD组和正常组的唇腺进行淋巴细胞灶性分级。

统计学处理使用SPSS 12.0统计软件对试验数据(腺泡阳性率)先进行平方根反正弦转换，得正态分布数据后，应用单因素方差分析比较正常、CTD和pSS 3组的LMP2和LMP7抗体的腺泡阳性率差异，再通过LSD和Tamhane法进行两两比较。采用配对t检验比较各组内的两种抗体之间的腺泡阳性率差异。用Spearman相关分析pSS组的腺泡阳性率与各临床检查结果的相关程度。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

HE染色结果正常、CTD和pSS 3组患者的唇腺组织进行淋巴细胞灶性分级结果显示，正常和CTD组的淋巴细胞灶性分级均不超过Ⅱ级，而pSS组中有38例均超过Ⅲ级(表1)。

免疫组织化学结果及定位将各唇腺切片LMP2和LMP7染色后的腺泡阳性率数据进行平方根反正弦转换后，得正态分布，再用单因素方差分析3组间LMP2、LMP7的阳性率差异(表2)，结果显示3组间LMP2的腺泡阳性率差异无统计学意义 (P=0.369)，LMP7的腺泡阳性率pSS组高于CTD组，CTD组高于正常组 (P<0.01)。再运用配对样本t检验在3组内分别对LMP2和LMP7染色后的腺泡阳性率进行比较，结果显示仅pSS组内的LMP7的腺泡阳性率高于LMP2(T=-7.948，P<0.01)。

LMP2和LMP7在唇腺组织中的表达免疫组织化学染色可见正常组在LMP2和LMP7染色后，仅腺泡细胞胞浆轻度着色，腺泡和导管细胞胞核少数着色；CTD组染色后，显示腺泡细胞胞浆着色较正常组稍深，部分腺泡细胞胞核着色，导管细胞少量着色；pSS组染色后，LMP2在部分腺泡细胞胞核和胞膜上有分布，侵润的淋巴细胞着色稍明显；LMP7染色后可见除腺泡细胞胞浆着色明显外，大部分胞核和胞膜着色，侵润的淋巴细胞着色明显，导管细胞大部分着色(图1)。

LMP2、LMP7的表达与临床表现间的相关性pSS患者的唇腺切片LMP2和LMP7腺泡阳性率(经平方根反正弦变换后)与抗SSA抗体、抗SSB抗体和抗核抗体(三者经对数转换后)、泪液分泌试验、淋巴细胞灶性分级、非刺激唾液流率和血清IgG的结果无相关性(P>0.05)(表3)。

讨 论

蛋白酶体是具有多相催化活性的蛋白酶复合体。在生物进化过程中，这种酶体表现出高度保守性, 它存在于所有真核细胞的胞浆及胞核中，无论在正常人还是干燥综合征患者的唇腺腺泡中均有分布，维持着细胞内的动态平衡[9]，本研究也验证了这个结果。26S蛋白酶体由20S核心复合物和两个19S调节复合物组成，多亚基和多催化中心的20S核心由7种α亚基和10种β亚基组成，其蛋白水解活性定位于β1、β2、β5亚基上，在促炎症因子干扰素-γ的诱导下，上述3个亚基可分别为有催化活性的β1i(LMP2)、β2i(MECL -1)和β5i(LMP7)亚基所替代, 形成具有活性的免疫蛋白酶体， 负责降解各种胞浆蛋白成为肽段，供T淋巴细胞识别[10]。蛋白酶体除在调节转录、细胞生长周期、分化、凋亡等细胞生长过程中发挥关键性作用，还控制应激和免疫反应。此外，蛋白酶体还在主要组织相容性复合物I类分子的抗原提呈、免疫应答和许多自身免疫病的发生发展过程中扮演重要角色[11]。LMP2和LMP7同为免疫蛋白酶体两个重要的蛋白水解亚单位，本研究pSS患者、CTD和正常人唇腺组织中的表达不同。

表 1 3组受试者唇腺的淋巴细胞灶性分级(n) Table 1 Lymphocytes focus-scores in the labial glands of three groups (n)

CTD：结缔组织病；pSS：干燥综合征

CTD：connective tissue disease；pSS：primary Sjögren’s syndrome

表 2 3组唇腺切片的LMP2和LMP7腺泡阳性率

LMP：低分子质量多肽

LMP: low molecular weight polypeptide

表 3 pSS组LMP2和LMP7腺泡阳性率与临床的相关性

本研究免疫组织化学检测显示LMP7在pSS组唇腺组织中表达明显上调，相比较CTD组和正常组差异具有统计学意义。主要分布在大多数的腺泡细胞和导管细胞的腔面和胞核上，侵润的淋巴细胞也有明显着色。近年研究显示在唇腺组织学上LMP7的mRNA表达水平，pSS组较CTD组或正常组内显著上调[5-6]。免疫蛋白酶体3个亚基的免疫组织化学比较显示LMP7表达增高，在导管细胞和腺泡细胞强表达[6]，这与本研究结果一致。但Morawietz 等[5]提取了17例pSS患者和11例非自身免疫病患者的唇腺组织进行免疫蛋白酶体3个亚基的免疫组织化学染色，结果显示LMP7表达在pSS组唇腺组织中有增高的趋势，但差异无统计学意义。考虑到该研究的样本量有限(仅28例并包括治疗中患者)，且免疫组织化学结果读取采用分级法，可能与本研究64例样本，通过读数腺泡阳性率半定量检测LMP7的表达有差异。

本研究LMP2的组织学表达pSS组、CTD组和正常组差异无统计学意义。有研究通过基因芯片分析显示人LMP2/β型蛋白酶体9和β型蛋白酶体10/MECL-1均位列pSS与正常人唇腺组织中的最差异基因排行前50位，提出LMP2、MECL-1在pSS患者唇腺内mRNA表达上调[4]。Morawietz 等[5]也在组织学上用RT-PCR法证实了上述观点，但通过免疫印迹法显示LMP2的蛋白表达水平明显下调。从外周血免疫蛋白酶体亚基的分析来看，在mRNA水平上，LMP2、MECL-1在pSS患者血单核细胞中明显上调，但在蛋白水平上LMP2在pSS组中明显下调[7]。本研究显示pSS患者唇腺内LMP2表达较对照组差异无统计学意义，与文献报道是一致的，这种现象说明LMP2在pSS体内是表达失调的。LMP2蛋白表达失调可能由于LMP2 mRNA转录后缺陷、翻译过程障碍或LMP2蛋白稳定性降低引起，导致腺实质细胞中LMP2抗原性的改变，不能用现有的技术检出组织中的LMP2，具体过程有待蛋白学上进一步的研究。蛋白酶体系统对于T细胞的发育和主要组织相容性复合物 I类分子的抗原提呈非常重要。目前尚无研究证实LMP2的蛋白表达失调导致pSS患者体内免疫蛋白酶体数量分布变化，但是pSS体内抗原提呈细胞的主要组织相容性复合物 I类分子结合的肽在数量和质量上均会有所改变，可能会促进自身免疫发病机制。

pSS唇腺内侵润的淋巴细胞上LMP7着色明显，由于侵润的淋巴细胞大部分是T细胞，干扰素-γ又是浸润性T细胞所产生，在其诱导下促使有活性的LMP2、MECL-1和LMP7生成并组成了免疫蛋白酶体。可见局部炎症促进免疫蛋白酶体功能亢进、加工抗原、促进提呈；引起胞内受损蛋白甚至正常蛋白的大量降解，进而导致细胞损伤。本研究结果提示，pSS患者LMP2和LMP7在腺泡细胞和导管细胞腔面的分布与唇腺中的淋巴细胞浸润灶评分无相关性，因为LMP7除了在浸润的淋巴细胞中，还在腺泡细胞和导管上皮细胞中高表达，因此与单独的淋巴细胞灶性分级可能无关。此外，目前尚不清楚这些蛋白酶体亚基是否是从炎性唾液腺组织释出的。

本研究pSS患者唇腺切片中LMP2和LMP7腺泡阳性率与临床检验结果显示：与抗SSA抗体、抗SSB抗体和抗核抗体、泪液分泌试验、淋巴细胞灶性分级、非刺激唾液流率和血清IgG均无相关性，其具体原因尚待进一步研究。

文献报道MECL-1需要LMP2的辅助才能有效地合并为蛋白酶体前体，而包含LMP2和MECL的蛋白酶体前体需要LMP7才能高效的成熟，组成免疫蛋白酶体[12]。本研究组织学显示pSS患者LMP7在腺泡细胞和导管细胞腔面的分布明显增多，LMP2的分布无明显改变，提示LMP7和LMP2两亚基的个体基因调节机制不同。建议下阶段可从基因和分子生物学水平对pSS的蛋白酶体系统进行研究，进一步理解蛋白酶体各亚基在致病机制中的意义及三亚基之间的关系，在组织学或细胞学上鉴别pSS特异性标记物，为pSS的早期诊断提出新的敏感指标和治疗方案。

(本文图1见插图第2页)

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ExpressionofProteasomeImmunosubunitinLabialGlandsofPatientswithPrimarySjögren’sSyndrome

LI Zhen1, LUO Yu-feng2, CAO Jin-ling2，GUO Chun-lan1, WANG Hong-lin1,XIAO Jing-lian1, ZHANG Jie1, ZHANG Ding1

1Department of Stomatology,2Department of Pathology, PUMC Hospital, CAMS and PUMC, Beijing 100730, China

ZHANG Ding Tel: 010-65296339, E-mail:dingz77@sina.com

ObjectiveTo investigate the expression of proteasome immunosubunit low molecular weight polypeptide (LMP)2 and LMP7 in labial glands of patients with primary Sjögren’s syndrome patients, and thus explore their role in the diagnosis, differential diagnosis and pathogenesis of primary Sjögren’s syndrome (pSS).MethodsLabial specimens were collected from 40 patients with pSS, 15patients with connective tissue diseases other than pSS, and 9 healthy controls. The expressions of LMP2 and LMP7 in labial specimens were determined using immunohistochemical approaches and analyzed using semi-quantitative methods. The positive rate of acinar was calculated. After the square arcsine transformation of data, the differences of the positive rate in acinar between LMP2 and LMP7 were compared among three groups. Spearman’s rank correlation coefficient was used for analyzing the correlation of clinical manifestations with LMP2 and LMP7 expressions.ResultsThe expressions of LMP2 and LMP7 within the acinar and ductal epithelial cells were confirmed. Although the LMP2 expression in labial specimens was not significantly different among three groups(P=0.369), the expression of LMP7 was significantly higher in pSS patients compared with patients with connective tissue disease and healthy controls (P<0.01). Only in pSS group, LMP7 was found to be with higher positive rate in acinar than LMP2 (P<0.01). No significant correlation was found between LMP2/LMP7 and clinical manifestations (P>0.05).ConclusionIn patients with pSS, the expression of LMP7 (but not LMP2) is up-regulated in labial gland, indicating these two proteins have different genetic regulation mechanisms.

primary Sjögren’s syndrome; proteasome; salivary glands

ActaAcadMedSin，2011,33(2)：146-150

张 丁 电话：010-65296339，电子邮件:dingz77@sina.com

R781

A

1000-503X(2011)02-0146-05

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.02.010

2010-10-29)