孔雀致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

崔焕忠，周佰祥，张 辉，范译文，康 倩，张加力，黄海龙，王 开

（1.吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春130118；2.吉林省磐石市动检站，吉林 磐石132300）

孔雀作为集观赏、食用、保健于一身的养殖珍禽，在很多地方都有养殖，但随着养殖量的增加，患病率也在逐渐增高，尤其是大肠杆菌病。大肠杆菌常引起禽类败血症、气囊炎、心包炎、肝周炎、肉芽肿、卵黄性腹膜炎、关节炎、眼炎、脐炎等病理变化，具有较高的发病率和死亡率［1］。由于大肠杆菌血清型太多，并且极易产生耐药性，为弄清本病流行情况及流行菌株的耐药性，从而科学指导用药，经常对大肠杆菌病进行病原的分离鉴定及药敏试验，以期指导临床诊治。2009年11月中旬，长春某珍禽养殖场所饲养的80只6月龄孔雀先后有20几只发生腹泻、肿脸、流泪等症状，继而死亡，经临床检查、病理剖检初步诊断为大肠杆菌病。从现场采集了病料，通过病原分离、生化培养、动物试验等，最终确定病原体为致病性大肠杆菌。分离的大肠杆菌用临床常用抗菌药物进行了药敏试验，根据药敏结果合理选择药物，有效地控制了该群孔雀的病情。有关本次试验报告如下。

1 材料

1.1 病料 无菌采集病死孔雀的肝脏、脾脏、胰腺和心血。

1.2 主要试剂 普通营养琼脂培养基、血琼脂培养基参照文献［2］配制；麦康凯培养基、伊红美蓝培养基及三糖铁培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司；细菌微量生化鉴定管及药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；大肠杆菌O 型单价阳性血清，购自中国兽医药品监察所。

1.3 主要仪器设备 恒温培养箱、生物显微镜、超净工作台、高速低温离心机、高压消毒器、分光光度计、pH计、微波炉、冰箱、水浴锅等常规设备。

1.4 试验动物 健康小鼠10只，购自长春生物制品所。

2 方法

2.1 病毒分离 取肝脏、脾脏、胰腺等组织，制备1∶5组织悬液，低温高速离心，取上清液，加入双抗感做4h后，过0.45μm针式滤器，滤液经尿囊腔接种9～10日龄鸡胚，孵育。剔除24h内死亡鸡胚，24h后死亡鸡胚置4℃冰箱保存。孵化至第4天，将未死亡鸡胚全部置4℃冰箱4h后收取尿囊液，并将鸡胚尿囊液盲传3代，做血凝试验（HA）［3－4］。

2.2 细菌分离 将无菌采集病死孔雀的肝脏及心血接种于血琼脂平板，置于培养箱中，37℃培养24～48h，挑取血琼脂平板上生长比较一致的单个菌落，接种于普通营养肉汤，37℃培养18～24h。

2.3 培养特性及显微镜镜检观察 将纯化的细菌分别接种于普通营养琼脂、麦康凯琼脂、三糖铁琼脂及伊红美蓝琼脂培养基，37℃培养24～48h，观察细菌生长情况；取纯化细菌涂片、固定、革兰染色后，在显微镜下观察细菌染色情况。

2.4 生化试验 将纯化的疑似大肠杆菌接种于常用细菌微量生化鉴定管，置于37℃培养18h后观察结果。

2.5 血清型鉴定 将麦康凯平板上的可疑菌落，接种于普通琼脂斜面，37℃培养24h，用石炭酸盐水洗下，形成浓缩菌液，115℃高压制成菌体抗原，按使用说明书进行抗原－抗体平板凝集试验，鉴定血清型［5］。

2.6 动物试验 无菌条件下将细菌的纯培养物用灭菌生理盐水洗下，制成细菌数约为1.5×108CFU/mL悬液［6］。将10只小鼠随机平均分成2组，每组5只，一组为试验组，一组为对照组。试验组小鼠每只腹腔注射菌悬液0.2mL；对照组每只腹腔注射灭菌生理盐水0.2mL。隔离饲养，观察小鼠的发病死亡情况。小鼠死亡后剖检尸体，将病变组织接种于麦康凯培养基上，挑取可疑菌落进行镜检、生化鉴定。

2.7 药敏试验 按“纸片法抗菌药物敏感试验标准”进行药敏试验［7］。用一无菌棉拭子蘸取校正为0.5麦氏单位的菌悬液，在管壁旋转挤压几次，去掉过多的菌液，均匀涂布于整个普通营养琼脂平板表面，待平板上的菌液稍干后，将药敏片依次均匀贴放到平板上。各纸片中心相距约24mm，纸片距平板边缘约15mm，各纸片间距离相等。将平板倒置于培养箱中，37℃培养16～18h，观察结果。以抑菌圈直径大小作为判定细菌对药物敏感性的标准，以敏感、中敏或耐药的形式解释结果。

3 结果

3.1 病毒分离结果 接种鸡胚后，孵化4d，结果均无死亡，收获尿囊液进行血凝试验，无血凝性。鸡胚尿囊液盲传3代，均无血凝性。排除了感染新城疫病毒及禽流感病毒。

3.2 细菌分离培养及镜检结果 从肝脏及心血中均分离到单一细菌，将分离的细菌接种普通营养琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂平板及三糖铁培养基，37℃培养24h后观察发现：细菌在普通营养琼脂平板生长良好，形成边缘光滑、湿润、半透明的灰白色菌落；在麦康凯琼脂平板上长出红色菌落；在伊红美蓝琼脂平板呈现紫黑色具有金属光泽的菌落；三糖铁培养基产酸产气。挑取单个菌落进行革兰染色，在油镜下观察，菌体呈现淡红色，为革兰阴性、呈单个或成双存在或呈短链排列的短杆菌。

3.3 生化试验 将纯化的疑似大肠杆菌分别接种葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇等细菌微量生化鉴定管，37℃培养18h后，其结果如表1所示，表明分离的细菌生化特性符合大肠杆菌的特征。

表1 分离细菌的生化反应

3.4 血清型鉴定结果 从不同病料中共分离致病性大肠杆菌9株，O抗原其中6株为O9，占66.7%；3株为 O2，占33.3%。

3.5 动物试验结果 在接种细菌24～48h内小鼠全部死亡。剖检死亡小鼠，发现肝脏肿胀出血，心外膜出血，从死亡小鼠的肝脏和心血中，分离得到与原分离菌株一致的革兰阴性杆菌。对照组无异常表现，这说明分离菌株为致病性大肠杆菌。

3.6 药敏试验 采用纸片法对分离纯化的大肠杆菌进行药物敏感性试验，结果如表2所示。由表2可以看出，该分离菌对卡那霉素、阿米卡星和氟苯尼考敏感；对其他几种药物中敏或耐药。

表2 分离菌株的药物敏感性试验结果

4 小结

4.1 结合发病孔雀的临床症状、病理剖检、病毒及细菌分离、细菌染色镜检、培养及生化鉴定，诊断该珍禽养殖场孔雀所患疾病为大肠杆菌病。经药敏试验筛选敏感药物治疗，本病迅速得到了控制。

4.2 大肠杆菌病是一种常发病，但是却难于控制，这不仅因为其血清型多，各血清型间无交叉保护性，而且不同血清型以及不同地区的大肠杆菌对药物敏感性也各不一致。该珍禽场经常使用头孢类药物预防细菌性疾病，导致分离致病性大肠杆菌对头孢类药物有明显耐药，而对未使用的氟苯尼考、阿米卡星和卡那霉素有高度敏感性。

4.3 大肠杆菌病是一种条件性疾病，因此对本病的预防重点在于搞好环境卫生和饲养管理，减少应激刺激，避免混合饲养以免交叉感染。

［1］ 甘孟侯.中国禽病学［M］.北京：中国农业出版社，2000：12－13.

［2］ 甘肃农业大学.兽医微生物学试验指导［M］.北京：中国农业出版社，1991：28－30

［3］ 傅继华.病毒学实用实验技术［M］.济南：山东科学技术出版社，2001：47－49.

［4］ 涂凌云，全炳昭，陈如圣，等.丹顶鹤源大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验［J］.中国兽医杂志，2010，46（2）：49－50.

［5］ 宋立，宁宜宝，张秀英，等.中国不同地区家禽大肠杆菌血清型分布和耐药性比较研究［J］.中国农业科学，2005，38（7）：1466－1473.

［6］ 何博.旧院黑鸡致病性大肠杆的分离与药敏试验［J］.四川畜牧兽医，2010，233（3）：26－30.

［7］ WS/T 125－1999.纸片法抗菌药物敏感试验标准［S］.