口虾蛄提取物对人鼻咽癌细胞P53、COX-2和VEGF表达的影响*

孔 霞， 顾帝水， 陈 锦， 黄培春

(广东医学院病理生理学教研室, 广东 东莞 523808)

口虾蛄提取物对人鼻咽癌细胞P53、COX-2和VEGF表达的影响*

孔 霞， 顾帝水， 陈 锦， 黄培春△

(广东医学院病理生理学教研室, 广东 东莞 523808)

目的研究口虾蛄提取物(EOS)对人低分化鼻咽癌细胞系(CNE-2Z)中P53、环氧化酶2(COX-2)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及意义。方法不同浓度EOS(0 mg/L、125 mg/L、250 mg/L和500 mg/L)作用CNE-2Z细胞24 h后，Western blotting检测P53蛋白表达，免疫细胞化学法及RT-PCR法分别检测COX-2 、VEGF蛋白和mRNA的表达。结果CNE-2Z细胞中P53蛋白、COX-2和VEGF蛋白和mRNA表达均随EOS作用浓度增高而逐渐降低，呈量效关系(P<0.01)；且COX-2 和VEGF表达量呈正相关(P<0.05)，COX-2 和P53表达量亦呈正相关(P<0.05)。结论EOS可能通过抑制CNE-2Z细胞中P53蛋白的表达,干扰COX-2和VEGF的表达而发挥其抗肿瘤作用的。

口虾蛄； 鼻咽癌； 蛋白质P53； 环氧化酶2； 血管内皮生长因子

口虾蛄提取物(extract ofOratosquilla, EOS)是本课题组从海洋生物口虾蛄中提取和分离的抗鼻咽癌活性成分[1-3]，其主要化学成分可能是生物碱类[3]。但其具体抗癌机制还不清楚，需要进一步深入研究。本研究旨在进一步探讨EOS对人低分化鼻咽癌细胞系(CNE-2Z)中P53、环氧化酶2(cyclooxygenase-2，COX-2) 和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的影响，以揭示EOS抗癌的可能机制。

材 料 和 方 法

1材料

EOS及CNE-2Z均由广东医学院肿瘤研究所提供；RT-PCR试剂盒(Qiagen)；RNA提取试剂盒(Trizol，Invitrogen)；PCR引物(由上海生工合成)；鼠抗人P53、COX-2和VEGF单克隆抗体为Santa Cruz。

2方法

2.1CNE-2Z细胞培养 采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，37 ℃、5% CO2孵箱中培养。取对数生长期细胞进行实验。

2.2EOS的提取、配制及实验分组 采用系统溶剂法提取分离获得口虾蛄乙酸乙酯提取物即EOS，具体方法参见文献[1]。EOS不溶于水，以二甲基亚砜(DMSO)溶解配制成1 kg/L，分装于4 ℃保存。临用前将EOS稀释成所需的浓度。实验分4组：实验前将溶解后的EOS加入各组细胞培养液中，使其终浓度分别为EOS 0 mg/L(对照组)、EOS 125 mg/L(低浓度组)、EOS 250 mg/L(中浓度组)、EOS 500 mg/L(高浓度组)，并使各组DMSO终浓度≤0.1%。

2.3免疫细胞化学法检测COX-2和VEGF蛋白表达 将CNE-2Z细胞制成1×108cells/L 的细胞悬液，接种于预先置有无菌盖玻片的6孔培养板中，待细胞贴壁后加入不同浓度的EOS，并使各组培养液DMSO浓度均为0.1%，同时设阴性对照组；EOS作用24 h后弃上清，用PBS洗3遍，再用冰丙酮固定15 min，自然干燥后采用SP法检测。

COX-2和VEGF皆为胞质着色。胞浆或胞膜出现棕色或棕褐色颗粒判断为阳性细胞，并采用LEICA-Q500IW图像分析仪定量检测阳性细胞平均吸光度A值代表其表达量。

2.4RT-PCR法检测COX-2 mRNA和VEGF mRNA表达 加入EOS后各组CNE-2Z细胞继续培养24 h后，用Trizol等试剂提取细胞总RNA。紫外分光光度计测定RNA的含量和纯度，取A260/A280>1.8的样品用于RT-PCR实验。应用Primer Premier 5.0软件和Web Primer 3软件进行引物设计。GADPH上游引物序列 5’-ACGGATTTGGTCGTATTGGG-3’，下游引物序列 5’-TCATTTTGGAGGGATCTCGC -3’，扩增产物大小为231 bp；COX-2上游引物序列 5’-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAAT-3’，下游引物序列 5’-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTT-3’，扩增产物大小为305 bp；VEGF上游引物序列 5’-CGAAACCATGAACTTTCTGCTGTC-3’，下游引物序列 5’-TCACCGCCTCGGCTTGTCACAT-3’，扩增产物大小为452 bp和583 bp。对应为VEGF121和VEGF165。扩增条件：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 1 min，50 ℃ (COX-2) 或 52 ℃ (VEGF)1 min，72 ℃ 1 min，共 30 (COX-2) 或 32(VEGF) 个循环；最后 72 ℃延伸5 min。取PCR扩增产物5 μL用 20 g/L琼脂糖凝胶 (内含嗅化乙啶) 电泳。紫外灯下观察并用Grab2It成像系统照相，然后用 Gelworks 1D interdiate软件分析各条带的积分吸光度(IA)，以IA(COX-2 或 VEGF)/IA(GADPH) 比值表示目的基因的相对表达量。

2.5Western blotting检测P53的表达 细胞处理同RT-PCR，取 1×106个细胞以细胞裂解液裂解，沸水变性3-5 min，超声波粉碎30 s，13 000 r/min 4 ℃离心10 min，取上清，考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白浓度。取等量蛋白样品进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿法电转移至硝酸纤维膜，膜与鼠抗人P53单克隆抗体4 ℃孵育过夜，再与羊抗鼠IgG 37 ℃孵育2 h，ECL检测，β-actin作为内参照。图像经Scion Image软件进行吸光度值分析，并与内参照β-actin比较，以相对吸光度值代表蛋白表达量。

3统计学处理

结 果

1免疫细胞化学染色结果

COX-2和VEGF蛋白在CNE-2Z 细胞中呈阳性表达，阳性细胞为细胞浆着棕褐色，染色强度与其表达量有相关性。经不同浓度的EOS处理后的CNE-2Z 细胞中COX-2和VEGF蛋白的阳性表达率随EOS的增高而降低,见图1，呈量效关系(P<0.01)。

Figure 1. Effects of EOS on the expression of COX-2 and VEGF in CNE-2Z cells(×200).

2RT-PCR法结果

如图2所示，CNE-2Z细胞COX-2 mRNA和VEGF mRNA表达扩增条带随EOS作用浓度的增加而渐减弱(n=3,P<0.01)，且COX-2 mRNA与VEGF mRNA相对表达量的变化趋势存在正相关(r=0.9720,P<0.05)。

Figure 2. Effects of EOS on the expression of COX-2 mRNA and VEGF mRNA in CNE-2Z cells.s. n=3.M: DNA marker；Lane 1: control group；Lane 2: EOS 125 mg/L group；Lane 3:EOS 250 mg/L group；Lane 4：EOS 500 mg/L group. **P<0.01 vs control group; ▲▲P<0.01 vs other groups.

3P53蛋白表达情况

如图3所示，EOS作用于CNE-2Z细胞24 h后，随着EOS浓度的增加， P53蛋白的表达逐渐下降(n=3,P<0.05)，且P53表达量与COX-2表达量的变化趋势呈正相关(r=0.9607,P<0.05)。

Figure 3. Effects of EOS on the expression of P53 in CNE-2Z cells.s. n=3. Lane 1: control group；Lane 2:EOS 125 mg/L group；Lane 3:EOS 250 mg/L group；Lane 4:EOS 500 mg/L group. **P<0.01 vs control group; ▲▲P<0.01 vs other groups.

讨 论

从海洋生物中筛选抗肿瘤活性物质是目前抗癌药物研究的热点之一。然而，利用海洋生物抗鼻咽癌的研究国内外报道极少。近年来，本研究室利用系统溶剂法从海洋生物口虾蛄中提取了抗鼻咽癌活性成分，发现其主要的化学成分可能是生物碱类，并申请了中国发明专利(专利号为ZL99102633.0)[3]。前期研究发现，口虾蛄提取物能抑制鼻咽癌低分化细胞系CNE-2Z细胞裸鼠移植瘤的生长，并能降低 CNE-2Z细胞体外侵袭能力[2]。这证明口虾蛄提取物确实具有抗鼻咽癌的作用。进一步的研究发现口虾蛄提取物不仅能够抑制鼻咽癌低分化和高分化细胞系CNE-2Z和CNE1的增殖，而且还能促进癌细胞的分化，并对其中的相关机制进行了初步的研究。但其具体抑癌机制还不清楚，需要进一步深入研究。据此，本研究选择了P53、COX-2和VEGF作为研究对象探讨EOS抗肿瘤的可能机制。

COX-2是催化花生四烯酸产生多种PGE2的限速酶，它在正常组织中一般不表达，但在包括鼻咽癌在内的多种肿瘤组织中表达增加[4-6]。研究资料表明[7，8]，COX-2与肿瘤细胞的增殖与凋亡紊乱、肿瘤新生血管的生成以及细胞间的黏附、侵袭等多个环节有关。COX-2抑制剂能抑制肿瘤细胞的生长[9]，诱导其凋亡，并能对抗肿瘤血管的生成，抑制肿瘤的侵袭性[10]。因此COX-2可作为鼻咽癌防治研究中的新靶点。本研究采用免疫细胞化学法和RT-PCR法分别检测了EOS对CNE-2Z细胞中COX-2在蛋白和基因水平的影响，结果表明随着EOS作用浓度的增加， COX-2在蛋白和基因水平的表达逐渐减弱，说明EOS的抗肿瘤作用可能与抑制COX-2的表达有关。

有研究表明COX-2的抗凋亡能力与P53有关。p53基因是研究最为广泛深入的抑癌基因之一，它是细胞生长周期中负调控因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化和细胞凋亡等重要生物学功能有关。p53基因分为野生型和突变型2种，野生型p53基因在某些致癌因素的作用下可发生突变，成为突变型p53基因，突变型p53基因在细胞内积聚，促进细胞的增殖和转化，导致肿瘤的发生。由于野生型P53蛋白在体内的半衰期极短，不易测出。鼻咽癌组织中p53基因突变率低，但是在细胞株和移植瘤中p53基因突变率增高[11，12]。因此，我们所检测到的为突变型p53。目前研究表明，野生型p53竞争性地结合COX-2上游启动子序列的TATA盒而抑制其表达。当野生型p53发生突变后，失去了对COX-2表达的抑制而促使COX-2表达上调[13]。COX-2的过表达导致Bcl-2/Bax比率增大，改变了Bcl-2与Bax之间的平衡从而抑制凋亡。本实验中Weatern blotting法实验结果显示CNE-2Z细胞中有较高的突变型P53蛋白的表达，且随着EOS浓度的增加突变型P53蛋白的表达逐渐降低，并且这种变化趋势和COX-2的变化有显著相关性(P<0.05)。实验结果提示了EOS也可能通过下调突变型P53蛋白的表达而干扰了COX-2的表达，从而抑制了CNE-2Z细胞的生长。

COX-2促进肿瘤形成还与其促进了肿瘤新生血管的生成有关。研究表明COX-2及其产物PGE2还可以促进肿瘤VEGF的表达而导致血管生成[14]，并且这种作用可被COX-2抑制剂所抑制[15]。本研究采用免疫细胞化学法和RT-PCR法分别检测了EOS对CNE-2Z细胞中VEGF在蛋白和基因水平的影响，结果表明EOS作用浓度的增加，VEGF在蛋白和基因水平的表达逐渐减弱，并且这种变化趋势和COX-2的变化有显著相关性(P<0.05)。说明EOS的抗肿瘤作用可能与下调COX-2的表达从而抑制了VEGF的表达有关。

以上实验结果提示EOS可能通过下调CNE-2Z细胞中突变型P53蛋白的表达而干扰了COX-2和VEGF的表达来发挥抗肿瘤作用的，这为EOS的进一步开发利用提供了新的思路。

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EffectsofextractofOratosquillaonexpressionofP53,COX-2andVEGFinhumannasopharyngealcarcinomacellline

KONG Xia, GU Di-shui, CHEN Jin, HUANG Pei-chun

(DepartmentofPathophysiology,GuangdongMedicalCollege,Dongguan523808,China.E-mail: 13828283890@139.com)

AIM: To study the inhibitory effect of the extract ofOratosquilla(EOS) on the expression of P53, cyclooxygenase-2(COX-2) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z.METHODSCNE-2Z cells were treated with different concentrations of EOS for 24 h. The methods of RT-PCR and immunocytochemistry were used to detect the expression of COX-2 and VEGF at mRNA and protein levels, respectively. The protein expression of P53 was determined by Western blotting.RESULTSAfter treated with EOS, the protein expression of P53 in CNE-2Z cells was decreased(P<0.01), and the expression of COX-2 and VEGF at mRNA and protein levels was also significantly decreased in a dose-dependent manner(P<0.01). The expression of COX-2 was positively correlated with that of VEGF(P<0.05), and a positive correlation between the expression of COX-2 and P53 protein(P<0.05) was also observed.CONCLUSIONEOS may play its antitumor effect by inhibiting the expression of P53, COX-2 and VEGF in nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2Z.

Oratosquillaoratoria; Nasopharyngeal neoplasms; Protein P53; Cyclooxygenase 2; Vascular endothelial growth factors

R739.6

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-035

1000-4718(2011)02-0390-04

2010-07-08

2010-10-12

湛江市科技攻关资助项目(No.2009C3101011)；广东医学院青年基金资助项目(No.XQ0502)

△通讯作者 Tel：0759-22896311; E-mail: 13828283890@139.com