测定羊血液中三苯双脒浓度的高效液相色谱方法的试验

席 耐,宋迎春,石保新,党新生,严 风,何国声

(1.新疆巴音郭楞蒙古自治州动物疾病控制与诊断中心,新疆库尔勒841000;2.新疆巴音郭楞蒙古自治州林业局,新疆库尔勒841000;3.新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所,新疆乌鲁木齐830000;4.中国农业科学院上海兽医研究所农业部寄生虫学重点开放实验室,上海徐汇200232)

三苯双脒(Tribendimidin)属于氨基苯脒类化合物,本品化学名称为N,N'-双-[4'-(1-二甲氨基乙亚基氨基)-1,4,-苯基二甲基亚氨。分子式为 C28 H 32N 6 452.60。分子结构图为：

三苯双脒是中国预防医学科学院寄生虫病研究所研制的一种新的抗肠道寄生虫病药物,具有驱虫率高、剂量低、作用快、广谱高效、低毒特点的国家一类新药。根据中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所等单位前阶段对畜禽进行的初步药效试验表明,该药对羊线虫、绦虫有高效驱虫作用,且无残留、对胎儿无致畸作用,是一种很有开发前景的新兽药。为加快三苯双脒在动物寄生虫病防治方面开发应用,发现三苯双脒在绵羊体内的动态变化规律,为临床合理用药提供参考依据,通过本试验建立了三苯双脒高效液相色谱血药浓度测定方法。

1 材料与方法

1.1 试验药品及试剂 三苯双脒(批号：0103,纯度＞99%),中国预防医学寄生虫病研究所药化研究室提供;三苯双脒肠溶片,中国农业科学院寄生虫研究所动物寄生虫病防治研究室提供;水杨酸(分析纯),中国上海五联化工厂生产;甲醇色谱纯,美国Fisher公司产品;甲苯(分析纯),中国医药集团上海化学试剂公司产品;三乙铵(分析纯),中国医药集团上海化学试剂公司产品;氢氧化钠,江苏曾湾化工厂产品;肝素钠,上海虹口东风化学试剂有限公司产品;去离子水,中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所提供;羊血桨,由中国农业科学院上海家畜寄生虫病研究所采集。

1.2 试验仪器设备 高效液相色谱仪,Waters2690输液泵,Waters2487紫外检测器,美国Waters公司生产;超低温高速离心机SIGMA Labor zentrfugen3K30,德国生产;医用离心机(80-2)上海手术器械厂生产;真空干燥箱Binder VD53#02-3833德国生产。

1.3 反相高效液相色谱法

1.3.1 色谱条件 美国Waters公司 Nova-pak C18色谱柱(3.9 mm×150 mm,4μm/L);Waters Nova-pak C18保护柱,流动相：甲醇：水：0.1 mol/L氯化钠=50∶47∶3,p H 值3,流速：0.6 mL/min,柱温：25℃,内标：水杨酸,检测波长：249 nm 。

1.3.2 样本预处理

1.3.2.1 药品及试剂预处理 准确称取101℃干燥之恒重的三苯双脒1.00 mg,置50 mL的容量瓶中,用甲醇溶解,配制成 20μg/mL的贮备液,-20℃保存。准确称取水杨酸6.00 mg用10 mL甲醇溶解,4℃保存。

1.3.2.2 生物样本预处理 三苯双脒储备液取试验所需量,分别用含内标的甲醇溶液稀释成1 000、500、200、100、50 ng/mL 三苯双脒的工作液,分别加入5个洁净的试管,真空干燥箱烘干或氮气吹干后,准确吸取绵羊血浆各加入1 mL,用旋涡振荡器混合均匀,即成浓度为分别 1 000、500、200、100、50 ng/mL血浆样本,向血浆样本中加入2 mol/L的氢氧化钠溶液1 mL,用旋涡振荡器充分混匀碱化后,加入4 mL甲苯,水平振荡15 min,再用离心机3 000 r/min离心15 min,分理出甲苯提取液,分别移置另外干净的试管中,在60℃真空挥干或氮气吹干甲苯,用含内标的甲醇溶液1 mL冲洗残留物,进样前对样品超滤或10 000 r/min离心10 min,取滤液或上清10μL进样,进行各种试验。

1.3.3 色谱行为试验 三苯双脒储备液取试验所需量,用含内标的甲醇溶液稀释成 1 000、200、50 ng/mL的标准溶液(内标浓度5μg/mL)。在上述色谱条件下,10μL进样,进行色谱行为考察。

1.3.4 线性试验

1.3.4.1 标准曲线试验 三苯双脒储备液取试验所需量,用含内标的甲醇溶液稀释成1 000、500、200、100、50 ng/mL的标准溶液(内标浓度5μg/mL),在上述色谱条件下,10μL进样,进行数据测定,所测得三苯双脒与内标峰面积比和标准品浓度等数据进行直线回归分析,并制作标准曲线。

1.3.4.2 校正曲线试验 三苯双脒储备液取试验所需量,用含内标的甲醇溶液稀释成1 000、500、200、100 ng/mL和50 ng/mL的标准溶液(内标浓度5μg/mL),分别加入5个洁净的试管,按血浆样本预处理方法处理后,在上述色谱条件下,10μL进样,进行血浆样本中药物浓度测定,所测得数据进行直线回归分析,并制作校正曲线。

1.3.5 回收率试验 三苯双脒储备液取试验所需量,用含内标的甲醇溶液稀释成浓度为1 000、500、200、100、50 ng/mL的标准溶液(内标浓度5μg/mL),分别加入5个洁净的试管,按血浆样本预处理方法处理后,在上述色谱条件进样10μL,血浆样本中药物浓度测定。所得血浆样本处理后样本各种浓度三苯双脒峰面积与标准液各种浓度三苯双脒峰面积进行比较,计算绝对回收率,计算公式：绝对回收率=yx/ys×100%。

1.3.6 精密度试验

1.3.6.1 当日精密度试验 三苯双脒储备液取试验所需量,用含内标的甲醇溶液稀释成浓度为1 000、500、200、100、50 ng/mL 的标准溶液(内标浓度5μg/mL),分别加入5个洁净的试管,按血浆样本预处理方法处理后,同一天在上述色谱条件下,10 μL进样,测定血浆样本中药物浓度。计算日内相对误差RSD。

1.3.6.2 间日精密度试验 三苯双脒储备液取试验所需量,用含内标的甲醇溶液稀释成浓度为1 000、500、200、100、50 ng/mL 的标准溶液(内标浓度5μg/mL),分别加入5个洁净的试管,按血浆样本预处理方法处理后,在15 d内,每隔3 d,在上述色谱条件下,10μL进样,测定血浆样本中药物浓度,计算日间相对误差RSD。

1.3.6.3 灵敏度试验 三苯双脒储备液取试验所需量,用含内标的甲醇溶液稀释成50、20、10、5 ng/mL和0 ng/mL的标准溶液(内标浓度5μg/mL),分别加入5个洁净的试管,按血浆样本预处理方法处理后,在上述色谱条件下,10μL进样进行测定色谱系统的基线,以基线噪声的3倍作为检测限。

2 试验结果

2.1 色谱行为试验结果 使用上述色谱行为试验方法,三苯双脒与内标物分理效果好,三苯双脒保留时间4.6 min,内标保留时间9.2 min,峰型尖锐,生物样本在三苯双脒与内标出峰处没有杂峰干扰,其色谱图见图1～3。

图1 三苯双脒色谱图

2.2 线性试验结果

2.2.1 标准曲线试验结果 使用上述标准曲线试验方法,进行测定,所得三苯双脒与内标峰面积比和标准品浓度进行直线回归分析,获得标准曲线的回归方程式：y=998.768x+1.355(r=0.999 9,n=5),从图可看出,理论浓度(y)与峰面积比(x)的线性关系良好(r=0.999 9,n=5),所得标准曲线见图3。

2.2.2 校正曲线试验结果 使用上述校正曲线试验方法,进行测定,所得三苯双脒与内标峰面积比和药物理论浓度进行直线回归分析,获得校正曲线的回归方程式：y=1 019.251x+3.844(r=0.999 6,n=5),从图可看出,理论浓度(y)与峰面积比(x)的线性关系良好(r=0.999 6,n=5),所获得校正曲线见图3。

2.3 回收率试验结果 使用上述回收率试验方法,进行测定,所得血浆样本处理后样本各种浓度三苯双脒峰面积与标准液各种浓度三苯双脒峰面积进行比较,计算绝对回收率,计算公式：绝对回收率=yx/ys×100%,在50～1 000 ng/mL浓度范围内,三苯双脒绝对回收率91%以上,结果见表1。

2.4 精密度试验结果

2.4.1 当日精密度试验结果 使用上述当日精密度试验方法,日内测定血浆样本中药物浓度,计算日内相对误差RSD,从数据可知,本法当日测定的结果稳定,相对误差(RSD)在7.7%以内,结果见表1。

2.4.2 日间精密度试验结果 使用上述日间精密度试验方法,日间测定血浆样本中药物浓度,计算日间相对误差RSD,从数据可知,本法日间测定的结果稳定,相对误差(RSD)在8.6%以内,结果见表1。

表1 回收率、当日及间日测定结果

2.5 灵敏度试验 使用上述灵敏度试验方法,上述色谱条件进行测定,从生物样品中提取三苯双脒,以基线噪声的3倍作为检测限。三苯双脒在生物样品中的最低检测限为10 ng/mL。

3 讨论

3.1 高效液相色谱方法的建立 本试验根据三苯双脒分子结构式,三苯双脒含有3个苯环,两个脒基的大分子结构。分子中含有多个氢键基团,选择甲醇/水冲洗剂,在选择甲醇和水(50∶50)作冲洗剂的情况下,其所含苯环与极性基团的比值3/4,大于其临界比值1/4。根据液相色谱常规分离模式的基本原则,选择反向色谱分离模式。因为三苯双脒分子结构中含有多个“=N-”两性基团,为防止所带电荷影响与色谱柱的结合,我们将流动相的pH值控制在3左右,并加入了适当浓度的反离子试剂。

通过对三苯双脒进行全波长(190～820 nm)扫描发现,三苯双脒在甲醇溶液中,于249、288 nm和378 nm处有较大吸收(见图3)。经过反复多次试验证明,以甲醇-水(50∶50)为流动相,内标为水杨酸的情况下,249 nm作为检测波长,灵敏度最高。

为了定量更准确,采用了内标法。选择了与三苯双脒的化学结构相近的水杨酸作为内标。通过试验证实,在上述流动相中水杨酸与三苯双脒的分离度 Rs＞2,分离良好。

温度在25℃的条件下,药物和内标的峰形尖锐,滞留时间稳定,当温度升高,色谱峰的峰形却受到明显的影响,为保证试验的准确性,我们将柱温控制在25℃。

根据以上情况选择的条件为 p H值 3,柱温25℃,流速0.6 mL/min,用甲醇-水(50∶50)并加入了适当浓度的反离子试剂,做流动相。

3.2 样本前处理 三苯双脒在氯仿中易溶,在N,N-二甲基甲酰胺中微溶,在甲醇和无水乙醇中极微溶,在水和稀碱液中几乎不溶。在萃取剂的选取中曾用乙腈、四氯化碳、二甲基亚砜等多种溶剂提取药物,效果都不理想。试用甲苯作萃取剂,回收稳定,相对回收率理想,所以,确定甲苯作萃取剂。对血浆碱化处理以后,再用甲苯萃取,实测血浆样本中药物浓度最高接近3 000 ng/mL,取其1/20为150 ng/mL,样本中药物检测最底限为10 ng/mL,标准药品浓度分别为 1 000、500、200、100、50 ng/mL,血浆样本中三苯双脒的绝对回收率91.9%以上。同样取5种质控样品的日内(n=5)精密度试验的RSD为7.7%以内,日内精密度良好(见表1)。间日(n=5)精密度试验 RSD为8.6%以内,日间精密度良好(见表1)。试验数据显示,该方法是一种灵敏、准确,重现性好,精密度高的液相色谱法,用作三苯双脒的临床药物代谢动力学研究切实可行。

参考文选：

[1] 任海南,成宝珠,庄兆农,等.驱钩虫新药三苯双眯的实验治疗研究[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1987,5(4)：262-264.

[2] 曹汉钧,孙风华,钱益新,等.国产新药三苯双眯治疗钩虫感染临床观察[J].中国寄生虫病防治杂志,2000,13(3)：184-185.

[3] 台凡力,何国声,徐梅倩,等.山羊血浆中三苯双眯的高效液相色谱检测方法的研究[J].中国兽药杂志,2004,38(9)：17-19.