磷脂酰肌醇3-激酶γ对急性胰腺炎小鼠胰腺腺泡细胞自噬作用的影响

贾文焯 孙建华 韦军民

·论著·

磷脂酰肌醇3-激酶γ对急性胰腺炎小鼠胰腺腺泡细胞自噬作用的影响

贾文焯 孙建华 韦军民

目的探讨磷脂酰肌醇3-激酶γ(PI3Kγ)对小鼠实验性急性胰腺炎胰腺腺泡细胞自噬作用的影响，并探讨其意义。方法野生型C57BL/6小鼠和PI3Kγ 基因敲除小鼠各18只，按数字表法随机分为对照组(6只)和急性胰腺炎(AP)组(12只)，采用蛙皮素50 μg/kg体重腹腔内注射7次、每次间隔1 h的方法制备AP模型。首次注射后7 h处死小鼠，光镜下观察胰腺病理学变化，免疫荧光检测自噬泡主要组成蛋白LC3颗粒，荧光分光光度计测定胰蛋白酶活性,蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白beclin1、LC3-Ⅱ和p62的表达。结果AP组野生型小鼠和PI3Kγ 基因敲除小鼠的胰腺自噬空泡数量分别为 (5.14±0.85)、(2.25±0.54)个/每高倍视野(HPF)，LC3荧光免疫颗粒数量分别为(78.6±9.38)、(26.4±4.21)个/HPF，胰蛋白酶活性分别为 (0.827±0.126)、(0.358±0.098)pmol/mg蛋白，各组间差异均具有统计学意义(P值均<0.05)。野生型小鼠的p62蛋白表达较PI3Kγ基因敲除小鼠显著减弱(0.11比0.92，P<0.05)，而LC3-Ⅱ、beclin1蛋白表达较PI3Kγ基因敲除小鼠显著增强(1.82比0.93,1.43比1.05，P值均<0.05)。结论AP时PI3Kγ可能通过增强小鼠胰腺腺泡细胞的自噬作用，促进胰蛋白酶原的活化及诱导腺泡细胞坏死。

胰腺炎； 磷脂酰肌醇3-激酶γ； 蛙皮素； 自噬

急性胰腺炎(AP)的早期特征是胰腺腺泡细胞胞质出现空泡[1-2]。研究表明，胞质空泡来源于细胞的自噬作用。自噬作用也参与胰蛋白酶原的活化过程，且与空泡的数量及AP的严重程度成正比[3-4]。磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt途径是自噬调控的主要通路之一，而此家族中的PI3Kγ在调控炎症细胞功能方面有重要作用。本实验采用PI3Kγ基因敲除小鼠制备AP模型，观察PI3Kγ对AP小鼠胰腺腺泡细胞自噬作用的影响，探讨其意义。

材料和方法

一、实验动物及分组

SPF级近交系C57BL/6野生型小鼠和PI3Kγ基因敲除小鼠各18只,雄性，8～12周龄,体重(25±7)g，由美国加州大学洛杉矶分校动物中心提供。按数字表法随机将两种小鼠分为AP组(12只)和对照组(6只)。采用腹腔内注射蛙皮素(美国Sigma公司) 50 μg·kg-1·h-1、共7次的方法制备AP模型；对照组腹腔内注射等容积生理盐水。7次注射后处死小鼠，获取胰腺组织。大部分置-80℃保存，小块组织用甲醛固定。

二、方法

1．胰腺病理学检查：按常规操作。取10个高倍视野计算空泡数，取均值。

2．自噬泡组成蛋白LC 3B检测：采用免疫荧光染色法。荧光显微镜下取10个高倍视野计算荧光颗粒数，取均值。

3．胰蛋白酶活性测定：冷冻的胰腺组织在液氮中研磨后，置于300～600 μl胰蛋白酶活性测定缓冲液A(5 mmol/L乙磺酸,pH6.5,1 mmol/L MgSO4,250 mmol/L蔗糖)中，取25 μl匀浆加入预热的缓冲液B(50 mmol/L Tris,pH8.0,150 mmol/L NaCl,1 mmol/L CaCl2)开始测定，30 s后暂停测定，加入3 μl 20 mmol/L的胰蛋白酶荧光底物Boc-Gln-Ala-Arg-AMCoHCl(Biomol International公司)，再测定300 s，记录至少5个时点的荧光值。λex为380 nm，λem为440 nm。通过荧光增量曲线斜率计算每毫克蛋白质中活性胰蛋白酶含量[3]。

4．自噬相关蛋白p62、LC3B、beclin1表达的检测：采用蛋白质印迹法。使用RIPA裂解液将胰腺组织制成匀浆。抗p62、beclin1(H300)一抗购自Santa Cruz公司，抗LC3B抗体购自Cell Signaling公司。ECL发光试剂盒购自Thermo scientific公司。最后用FluorChem®HD2凝胶成像系统成像及Alpha View图像定量分析软件分析电泳条带灰度值，以AP组与对照组的比值表示蛋白表达的倍数。

三、统计学分析

结 果

一、胰腺病理改变

对照组的野生型和PI3Kγ基因敲除小鼠的胰腺组织大体及镜下均无明显变化，空泡数量分别为(0.39±0.09)、(0.38±0.12)个/每高倍视野(HPF)，LC3荧光颗粒数分别为(5.45±1.25)、(4.66±1.28)个/HPF。AP组野生型小鼠的胰腺肿胀,色暗红,表面见多处皂化斑及出血点,胰腺与周围组织分界不清，大网膜、肠系膜可见多发出血点；镜下见胰腺高度水肿,细胞结构模糊不清,胞质内空泡形成,局部有融合性坏死灶，坏死区内大量中性粒细胞和单核细胞浸润，空泡数量为(5.14±0.85)个/HPF，LC3荧光颗粒数为(78.6±9.38)个/HPF。AP组PI3Kγ基因敲除小鼠的胰腺肿胀,色暗红,表面未见皂化斑及出血点,胰腺与周围组织分界尚可，大网膜、肠系膜可见少量出血点；镜下见胰腺轻度充血、水肿,少量中性粒细胞和单核细胞浸润,少数局灶性腺泡坏死，空泡数量为(2.25±0.54)个/HPF，LC3荧光颗粒数为(26.4±4.21)个/HPF。AP组的空泡数量、LC3颗粒数均显著高于对照组(P值均<0.05)；AP组PI3Kγ基因敲除小鼠较野生型小鼠均明显减少(P值均<0.05)。

二、胰腺组织胰蛋白酶活性变化

对照组的野生型和PI3Kγ基因敲除小鼠的胰蛋白酶活性分别为(0.186±0.058)、(0.146±0.035)pmol/mg蛋白，两者无显著差异。AP组的野生型和PI3Kγ基因敲除小鼠胰蛋白酶活性分别为(0.827±0.126)、(0.358±0.098)pmol/mg蛋白，PI3Kγ基因敲除小鼠较野生型小鼠明显降低(P<0.05)。

三、p62、LC3-Ⅱ、beclin1蛋白表达的变化

AP组与对照组野生型小鼠胰腺p62、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、beclin1蛋白表达量比值分别为0.11、3.23、1.82、1.43； PI3Kγ基因敲除小鼠的比值分别为0.92、4.20、0.93、1.05(图1)。野生型小鼠胰腺p62蛋白表达较PI3Kγ基因敲除小鼠明显减弱(P<0.05)，而LC3-Ⅱ、beclin1蛋白表达较PI3Kγ基因敲除小鼠显著增加(P值均<0.05)，LC3-Ⅰ蛋白表达则无显著差异。

图1两AP组小鼠胰腺组织中p62、LC3-Ⅱ、beclin1蛋白表达

讨 论

自体吞噬在进化过程中高度保守，参与清除胞质内受损的细胞器、代谢产物，降解绝大多数的长半衰期蛋白质[1]。自噬的形态学改变是自噬泡的形成。自噬作用可将胰蛋白酶原转运到酸性环境中，然后进入溶酶体，导致胰蛋白酶原的激活。LC3蛋白是自噬泡主要的组成蛋白，定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，参与自噬体的形成，现已作为自噬体的特异性标记蛋白。其中LC3-Ⅱ表达量的变化在一定程度上反映了细胞的自噬活性的变化[5]。

自体吞噬的调控机制非常复杂，磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt途径是自噬调控的主要通路之一。PI3Kγ参与调控细胞的自噬过程。Lupia等[6]应用PI3Kγ基因敲除小鼠制备AP模型，结果可明显减轻腺泡细胞的损伤与坏死。本实验使用PI3Kγ基因敲除小鼠，其胰腺腺泡细胞内空泡数量及LC3-Ⅱ颗粒数量、胰蛋白酶活性与野生型小鼠无明显差异，但应用蛙皮素制备AP模型后，其胰腺腺泡细胞内空泡数量及LC3-Ⅱ颗粒数量均较野生型小鼠明显减少、胰蛋白酶活性也较野生型小鼠明显降低，证实PI3Kγ参与AP发展过程中的自体吞噬作用。

p62是一种泛素结合蛋白及LC3结合蛋白，主要通过自噬代谢。在自噬功能正常或过剩时，p62会被及时代谢，如果p62发生集聚，说明自噬过程受到抑制[7]。本实验结果显示，PI3Kγ基因敲除小鼠的p62蛋白表达水平高于野生型小鼠，提示PI3Kγ基因敲除可减弱自体吞噬过程。

Beclin1是哺乳动物最早发现的一个自噬基因,主要通过与Ⅲ型PIK形成复合体来调控其他自噬蛋白定位到自噬前体的结构中，从而调节自噬活性[8],其表达强度与自噬活性密切相关。本实验结果显示，PI3Kγ基因敲除小鼠诱发AP后胰腺组织中beclin1蛋白的表达明显低于野生型小鼠，也提示PI3Kγ基因敲除可减弱自体吞噬过程。

总之，PI3K 可能在自体吞噬早期阶段通过促进LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化和beclin1的表达增强自噬作用，促进胰蛋白酶原的活化，从而加速细胞坏死过程。

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2011-02-15)

(本文编辑：吕芳萍)

InfluenceofPI3Kgammaonpancreaticacinarcellsautophagyinexperimentalacutepancreatitisinmice

JIAWen-zhuo,SUNJian-hua,WEIJun-min.

DepartmentofGeneralSurgery,BeijingHospital,Beijing100730,China

JIAWen-zhuo,Email：jiawenzhuo@sina.com

ObjectiveTo investigate the influence of phosphoinositide 3-Kinase-C2-gamma (PI3Kγ) on pancreas acinar cells autophagy in experimental acute pancreatitis in mice and explore its significance.MethodsEighteen C57BL/6 wild type (WT) and eighteen PI3Kγ knockout (KO) mice were randomly divided into control group (n=6) and acute pancreatitis (AP) group (n=12) ,respectively. AP models were induced by intraperitoneal injection of 50 μg cerulein /kg body weight, once the other hour for seven times. The mice were sacrificed 7 hours after model induction．The pathological changes of the pancreas were observed through microscope, LC3 dots were determined by immunofluorescence, the trypsin activity was measured by fluorescence spectrophotometer, and the expression of autophagy related protein beclin1, p62 and LC3-Ⅱ were measured by Western blot.ResultsThe autophagy vacuoles counts in pancreatic tissue of WT mice and KO mice were (5.14±0.85), (2.25±0.54)/HPF, the LC3 immunofluorescence dots counts were (78.6±9.38), (26.4±4.21)/HPF, the trypsin activities were (0.827±0.126), (0.358±0.098)pmol/mg protein, the difference between the two groups was statistically significant (P<0.05). The p62 protein expression was greatly decreased in WT mice compared with their KO counterpart (0.11vs0.92,P<0.05), while the expressions of LC3Ⅱ, beclin1 were greatly increased in WT mice compared with their KO counterpart (1.82vs0.93, 1.43vs1.05,P<0.05).ConclusionsPI3Kγ may up-regulate autophagy of pancreatic acinar cells during acute pancreatitis in mice, then promote trypsinogen activation and necrosis of acinar cells.

Pancreatitis; Phosphoinositide 3-Kinase-C2-gamma; Cerulein; Autophagy

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.012

100730 北京，卫生部北京医院普通外科

贾文焯，Email: jiawenzhuo@sina.com