大黄对急性坏死性胰腺炎大鼠炎性介质表达的影响

金晶 高军 吕顺莉 刘枫 龚燕芳 满晓华 吴红玉 李兆申

·论著·

大黄对急性坏死性胰腺炎大鼠炎性介质表达的影响

金晶 高军 吕顺莉 刘枫 龚燕芳 满晓华 吴红玉 李兆申

目的观察中药生大黄空肠灌注对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺组织炎性介质表达的影响。方法SD大鼠33只，按完全随机法分为对照组、ANP组及生大黄治疗组，每组11只。胰胆管逆行注射3%牛磺胆酸钠溶液方法制备ANP模型，同时做空肠造瘘。生大黄组于造模后空肠灌入1 g/ml生大黄煎液1 ml/kg体重。造模36 h后处死大鼠。取血测定淀粉酶活性；取部分胰腺组织常规病理检查；取部分胰腺组织抽提总mRNA,采用实时PCR方法测定胰腺组织IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达。结果造模后大鼠血淀粉酶活性明显升高，胰腺组织大片坏死、出血，大量炎细胞浸润，符合ANP改变。对照组胰腺组织IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达量分别为0.29±0.13、0.35±0.15、1.09±0.32；ANP组分别为2.23±0.49、2.26±0.51、5.24±0.59，均较对照组显著增加(P值均<0.05)；生大黄组分别为0.97±0.30、1.02±0.34、2.59±0.36，均较ANP组显著减少，但仍显著高于对照组 (P值均<0.05)。结论生大黄空肠灌注治疗ANP大鼠可减少胰腺组织IL-6、IL-8、TNF-α mRNA的表达，从而减轻胰腺的病理损伤。

胰腺炎，急性坏死性； 白细胞介素6； 白细胞介素8； 肿瘤坏死因子-α； 大黄

在重症急性胰腺炎(SAP)早期，给予患者大黄可阻断胃肠道菌群易位，保护胃肠黏膜屏障，控制内源性感染，维持肠道内菌群的生态平衡，改善肠道黏膜的血液灌流量，减少局部渗出，促进炎症吸收[1]。此外，大黄还可促进肠蠕动，缓解肠麻痹，有助于胆汁、胰液的引流通畅和胆道炎症的控制，消除胆源性胰腺炎的病因[2]。但是关于大黄对SAP治疗作用的研究主要集中在临床疗效病例报道及回顾性分析，而相关的作用机制研究较少。本研究观察生大黄煎液干预急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠后胰腺组织中IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达的变化，探讨大黄治疗ANP的作用机制。

材料与方法

一、材料

健康雄性SD大鼠购自第二军医大学实验动物中心，清洁级，3～4个月龄，体重250～300 g。牛黄胆酸钠购自SIGMA公司，24G一次性留置静脉针为江苏碧迪医疗器械有限公司提供，Trizol购自Invitrogen公司，IL-6、IL-8、TNF-α mRNA引物由上海生工公司合成,反转录试剂盒购自TAKARA公司，荧光定量PCR试剂盒购自TAKARA公司，荧光定量PCR仪器为美国ABI公司产品，生大黄煎液(产地：甘肃)由长海医院中药房煎制，浓度1 g/ml。

二、ANP模型制作及分组

SD大鼠33只，按分层随机法分为对照组、ANP组和生大黄灌注组，每组11只。无菌条件下以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉并固定大鼠。于剑突下约3 cm处腹壁正中切口入腹。循胃、十二指肠球及降部暴露胰腺，找到主胰管。以24G静脉套管针于主胰管对侧肠壁刺入肠腔，稍退出针芯，循乳头将软套管穿入胰胆管约0.5 cm，动脉夹固定，另于胰胆管上方近肝门处动脉夹钳夹。用微泵将3%牛磺胆酸钠溶液按30 mg/kg体重、12 ml/h速度注入。完毕后拔除套管针。以直径2 mm的无菌塑料管于屈氏韧带远端8 cm处斜行穿刺置入行空肠造瘘，由腹壁引出并固定于背部，关腹。生大黄组模型制作及空肠造瘘同ANP组。对照组开腹只翻动十二指肠后关腹。ANP组术后经造瘘管按1 ml/kg体重匀速灌入蒸馏水，生大黄组灌入1 g/ml生大黄煎液1 ml/kg体重。制模后36 h处死大鼠。

三、方法

1．血淀粉酶测定及胰腺病理学检查：大鼠处死前静脉取血2 ml，分离血清后送实验诊断科测定血淀粉酶活性。无菌条件下取胰腺组织，部分甲醛固定，常规病理检查，部分液氮冷冻后置-80℃保存。

2．IL-6、IL-8、TNF-α mRNA检测：采用实时PCR法检测。取100 mg冷冻胰腺组织，碾成粉末，用Trizol抽提总RNA。根据GenBank公布的cDNA序列，利用Primer5软件设计引物。IL-6上游引物：5′-AGGCTTCCTTGTGCAAGTGT-3′，下游引物：5′-TGAGTGACACTGCCTTCCTG-3′，产物230 bp；IL-8上游引物：5′-CATCGAAGGGTTAAAGTGCCA-3′，下游引物：5′-ATAGTGTGTAGGTTGTTGTCC-3′，产物 104 bp；TNF-α上游引物：5′-ACTCCCAGAAAA-GCAAGCAA-3′，下游引物：5′-CGAGCAGGAATG-AGAAGAGG-3′，产物 211 bp。以β-actin为内参。先逆转录成cDNA，然后上ABI公司的7500型实时定量PCR仪检测。反应体系：2×PCR Master Mix 10 μl，DyeⅡ 0.5 μl(10 μmol/L)，上、下游引物各1 μl(5 pmol/L)，cDNA 1.0 μl，ddH2O 6.5 μl。反应条件：95℃ 10 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40个循环。利用实时PCR仪自带软件获得Ct值，△△Ct=△Ct样本-△Ct对照=(Ct样本-Ct内参)-(Ct对照-Ct内参)，表达量RQ=2-△△Ct。

四、统计学分析

结 果

一、血清淀粉酶活性变化

造模36 h后，对照组、ANP组和生大黄组大鼠血清淀粉酶活性分别为(1431±369)、(5684±452)、(5721±554)U/L，ANP组和生大黄组显著高于对照组(P值均<0.05)，而ANP组和生大黄组间差异无统计学意义。

二、胰腺组织病理改变

对照组胰腺腺泡结构完整，无炎细胞浸润；ANP组胰腺组织大片坏死、出血，大量炎细胞浸润；生大黄组胰腺腺泡结构尚好，间质水肿，较多炎细胞浸润，以中性粒细胞为主(图1)。

图1对照组(a)、ANP组(b)、生大黄组(c)大鼠胰腺病理改变(HE ×200)

三、胰腺组织IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达

ANP组大鼠胰腺IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达水平较对照组显著增加；生大黄组胰腺IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达较ANP组显著减少，但仍显著高于对照组(P值均<0.05；图2，表1)。

图2各组胰腺组织IL-6(a)、IL-8(b)、TNF-α(c) mRNA表达

组别只数IL⁃6mRNAIL⁃8mRNATNF⁃αmRNA对照组110．29±0．130．35±0．151．09±0．32ANP组112．23±0．49a2．26±0．51a5．24±0．59a生大黄组110．97±0．30ab1．02±0．34ab2．59±0．36ab

注：与对照组比较,aP<0.05；与ANP组比较,bP<0.05

讨 论

近年来大量的研究表明，急性胰腺炎(AP)除局部病变外，也是一种累及胰腺周围组织和远隔器官、系统的急性炎症过程。SAP损害的最初反应是细胞分子网的反应。体内各种细胞因子及炎性介质一经启动，即可发生全身性的炎症级联反应，促进AP的发展。促炎性细胞因子主要有IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1等，抑炎性细胞因子有IL-10、转化性生长因子等，它们共同作用介导炎症的发展[3]。IL-6是一种重要的急性反应期炎症介质，能很好地反映AP的严重程度，可作为预测AP程度的重要指标[4]。TNF-α由胰腺实质中浸润的白细胞产生，除刺激IL-6、IL-8产生外，还能刺激产生并播散几乎所有严重败血症中的有害物质。TNF-α的大量失控性释放是导致SAP的重要因素[5]。TNF-α和IL-6、IL-8可以启动级联反应，促进其他细胞因子的分泌，进而造成胰腺组织的水肿、出血和坏死，并且可以作用于血管内皮细胞引起微循环障碍、休克等 。

SAP病程早期具有中医阳明腑实证的特点，临床常采用通里攻下法为主进行治疗，其主要药物就是大黄。大黄味苦性寒,攻积导滞、泻火解毒，具有促进大肠蠕动、维护肠道屏障功能、防治肠菌易位、利胆、松弛Oddi括约肌、抑制胰酶分泌、改善微循环和防治微血栓形成等作用[6]。焦东海等[7]从大黄中获得了对胰酶具有活性的10种单体。在三硝基苯磺酸诱导的大鼠直肠炎模型中，采用地塞米松治疗具有强效的抑炎效果，但也具有明显的免疫抑制效应。地塞米松联合大黄多糖治疗，不仅具有抗炎作用，而且可以调控大鼠机体的免疫反应，可以诱导Th1淋巴细胞的增殖,促进Th1/Th2细胞的平衡，显著改善组织炎症反应[8]。本实验结果显示，ANP大鼠胰腺组织IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达较对照组显著增加，提示机体处于促炎细胞因子占优势的状态。而生大黄治疗组大鼠胰腺组织IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表达值显著低于ANP组，显示大黄可以抑制促炎因子的表达，同时胰腺组织坏死、充血、炎细胞浸润也较ANP组显著改善。因此，临床上早期鼻饲或空肠灌注生大黄煎剂有可能阻止SAP病情的进展，且生大黄价格低廉，使用简单，值得临床推广应用。

[1] 李杰,李贺,孙备,等.大黄联合电针促进重症急性胰腺炎胃肠道功能复苏的临床研究.中国中西医结合杂志,2009,29:661-662.

[2] 王春伟,宁建文,骆丹东.大黄素对大鼠重症急性胰腺炎肠黏膜屏障的保护作用.浙江医学,2009,31:863-865.

[3] Catalin V, Klaus B, Mircea O, et al. Severe acute pancreatitis between systematic inflammatory response syndrome and sepsis: insights from a mathematical model of endotoxin tolerance. Am J Surg, 2007,194:S33-S38.

[4] Bhatnagar A, Wig JD, Majumdar S．Expression of activation, adhesion molecules and intracellular cytokines in acute pancreatitis. Immunol Lett,2001,77:133-141.

[5] Ho YP, Chiu CT, Sheen IS, et al. Tumor necrosis factor-α and interleukin-10 contribute to immunoparalysis in patients with acute severe pancreatitis．Hum Immunol,2011,72:18-23.

[6] 陈德昌,姜兴禄，李红江，等．大黄对危重症患者胃肠粘膜血流灌注的影响．中国急救医学,1999,19:581-584．

[7] 焦东海,陈琼华,王文风，等．单味大黄治疗急性胰腺炎的实验研究．中国中医急症,1993,2:76-79．

[8] Liu L, Yuan S, Long Y, et al. Immunomodulation of Rheum tanguticum polysaccharide (RTP) on the immunosuppressive effects of dexamethasone (DEX) on the treatment of colitis in rats induced by 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid. Int Immunopharmacol,2009, 9:1568-1577.

2011-03-10)

(本文编辑：屠振兴)

Inhibitionoftheexpressionofinflammationcytokinesbyrhubarbinexperimentalacutenecrotizingpancreatitisrats

JINJing,GAOJun,LÜShun-li,LIUFeng,GONGYan-fang,MANXiao-hua,WUHong-yu,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email：zhsli@81890.net

ObjectiveTo observe the changes of inflammation cytokines in pancreas tissues of experimental acute necrotizing pancreatitis (ANP) rats treated with rhubarb.MethodsThirty-three rats were randomly divided into sham operation group, ANP group and rhubarb treatment group with 11 rats in each group．ANP model was induced by retrograde injection of 3% sodium taurocholate into the biliopancreatic duct, and jejunostomy was performed. Rats in rhubarb treatment group were fed with 1 g/ml rhubarb at the dose of 1 ml/kg body weight via jejunum route. Thirty-six hours later the rats were sacrificed. The serum level of amylase was measured; part of the pancreatic tissue was harvested for routine pathologic examination; total RNA was extracted from pancreatic tissue. The expression of IL-6, IL-8, and TNF-α mRNA was measured by real-time PCR.ResultsAfter ANP induction, the serum level of amylase was significantly increased, and pancreatic tissue necrosis, bleeding and inflammatory cell infiltration were observed, which was consistent with changes of ANP. The expressions of IL-6, IL-8, and TNF-α mRNA were 0.29±0.13, 0.35±0.15, 1.09±0.32 in sham operation group, while they were 2.23±0.49, 2.26±0.51,5.24±0.59 in ANP group, which were significantly higher than those in sham operation group (P<0.05). The corresponding values were 0.97±0.30, 1.02±0.34, 2.59±0.36 in rhubarb treatment group, which were significantly lower than those in ANP group, but they were still significantly higher than those in sham operation group (P<0.05).ConclusionsRhubarb lavage via jejunum route can decrease the expressions of IL-6, IL-8, and TNF-α, therefore attenuate the pancreatic pathologic injuries.

Pancreatitis, acute necrotizing; IL-6; IL-8; TNF-α; Rhubarb

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.06.014

国家自然科学基金(30772138)；上海市重点科技攻关项目(11441901800)

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

李兆申，Email：zhsli@81890.net