亚低温治疗对大鼠脑梗死后Bax和Bcl－2表达的影响

王玉凯 任 丽 陶恩祥

亚低温可以降低脑缺血后细胞代谢率、减少细胞能量消耗、降低血管的通透性等减轻脑损伤后的脑水肿、降低颅内压，有效降低脑代谢活动，促进神经功能恢复［1～4］，但亚低温治疗对缺血性脑损伤的保护作用的具体机制还不确定。本研究的目的通过急性脑梗死的大鼠模型，观察亚低温条件下Bax、Bcl－2的表达变化，探讨亚低温治疗缺血性脑损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立及分组

SPF级雄性健康SD 大鼠46只，由中山大学北校区动物实验中心提供（体重280～330 g）。符合国家卫生部颁发的实验动物清洁级标准（实验动物质量合格证许可证号：SCXK（粤）2004－0011 粤监证号2008A010）。模型制备在中山大学北校区动物实验中心完成（屏蔽动物实验室使用证明编号：NO：0021275），手术场所及所用器具严格消毒，全部操作在无菌条件下进行。实验期间大鼠饲养于中山大学北校区动物实验中心，动物房光暗周期12 h。

根据随机数字表将模型鼠随机分为常温组（normal temperature group，NT）10 只、亚低温组（mild hypothermic group，HT）30只，亚低温组又分3 h组、6 h组、12 h组，每组各10只。各实验分组每一时间点每种检测方法（TTC 染色和免疫组化）各选取5只大鼠用于观察。

所有大鼠术前12 h 禁食，术前6 h 禁水，线栓法制作局灶性脑梗死模型［5］。常温组大鼠手术过程中用电暖器维持肛温在37～38℃，术后转移到温度为25 ℃的房间；亚低温组大鼠分别在缺血后3、6、12 h采用喷洒酒精和电扇降温的方法在10 min内使肛温降至30 ℃（相应于脑温33 ℃［6］），然后转移到温度为5 ℃的房间，在5 ℃的房间里维持大鼠肛温在30 ℃［7］，缺血24 h后取材观察。

假手术组（sham operation，SO）6 只大鼠：除不插鱼线外，其余操作与模型组相同。术后把大鼠转移到温度为25℃的房间，每一时间点每种检测方法（TTC染色和免疫组化）各选取3只大鼠用于观察。

1.2 动物模型神经功能评分

根据Bederson评分标准［8］对各组动物模型在各时间点进行评分。

1.3 TTC 染色

3.5%的水合氯醛过量麻醉大鼠，快速取脑组织放入－20℃冰箱，待组织冻硬后进行冠状位切片（片厚2 mm）；放入2%TTC（避光）染色30 min（37℃），4%多聚甲醛固定24 h后拍照。用图像分析软件测定每张脑片的面积和梗死面积，由梗死面积×切片厚度＝梗死灶体积，全脑面积×切片厚度＝全脑体积［9］，以梗死体积百分比＝（梗死灶体积／全脑体积）表示缺血后脑损伤的严重程度。

1.4 免疫组织化学

经灌注固定、梯度蔗糖脱水后，常规石蜡包埋，然后行冠状位切片，片厚5μm，进行免疫组化检测；一抗为兔抗Bcl－2、Bax、caspase－3（SANGA CRUZ产品），二抗为生物素化山羊抗兔IgG（Boster公司产品），每张切片于高倍镜（400倍×）下梗死灶周边区皮质和纹状体的5个视野计数，取其平均数［10］。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 神经功能评分

假手术组大鼠不出现神经功能缺失的表现，评分为0；常温组和亚低温组大鼠术后出现不同程度局灶性神经功能缺损表现；亚低温组大鼠神经功能缺损表现比常温组轻，随亚低温治疗开始时间的延后，神经功能缺损表现逐渐加重（P＜0.05）（表1）。

表1 各组大鼠神经功能评分（±s）

表1 各组大鼠神经功能评分（±s）

注：与NT 组比较，＊P＜0.05；与6 h、12 h组比较，△P＜0.05；与12 h组比较，▲P＜0.05。

指标 SO 组 NT 组 HT3 h组 HT6 h组 HT12 h组神经功能评分 0 2.35±0.16 1.46±0.19＊△1.93±0.16＊▲2.12±0.17＊

2.2 脑梗死体积百分比

假手术组无脑梗死灶出现。亚低温组脑梗死体积百分比明显小于常温组（P＜0.01）；亚低温各组脑梗死体积百分比：3 h＜6 h＜12 h（P＜0.05）（表2）。

表2 各组脑梗死体积百分比（±s，%）

表2 各组脑梗死体积百分比（±s，%）

注：与NT 组比较，＊P＜0.05；与6 h、12 h组比较，△P＜0.05；与12 h组比较，▲P＜0.05。

指标 SO 组 NT 组 HT3 h组 HT6 h组 HT12 h组脑梗死体积百分比 0 22.35±0.16 15.46±0.19＊△17.93±0.16＊▲20.13±0.17＊

2.3 免疫组织化学

2.3.1 Bax表达变化 Bax表达阳性细胞仅胞浆着色呈棕黄色。常温组和亚低温组Bax表达阳性细胞数较假手术组明显增加。亚低温组比常温组Bax表达阳性的细胞数明显减少（P＜0.05）。亚低温各组Bax表达阳性细胞数：3 h＜6 h＜12 h（P＜0.05）（表3、图1～4）。

2.3.2 Bcl－2表达变化 Bcl－2表达阳性细胞胞浆着色呈棕黄色。常温组和亚低温组Bcl－2表达阳性细胞数较假手术组明显增加。亚低温组比常温组Bcl－2阳性细胞数增加（P＜0.05）。亚低温各组Bcl－2表达阳性细胞数依次是3 h＞6 h＞12 h（P＜0.05）（表4、图5～8）。

表3 各组Bax阳性细胞数的比较（±s，个／每个400倍视野）

表3 各组Bax阳性细胞数的比较（±s，个／每个400倍视野）

注：与NT 组比较，＊P＜0.05；与6 h、12 h组比较，△P＜0.05；与12 h组比较，▲P＜0.05。

指标 SO 组 NT 组 HT3 h组 HT6 h组 HT12 h组Bax阳性细胞数 1.60±1.24 53.20±5.81 24.60±5.94＊△ 38.00±4.00＊▲ 46.00±7.58＊

表4 各组Bcl－2阳性细胞数比较（±s，个／每个400倍视野）

表4 各组Bcl－2阳性细胞数比较（±s，个／每个400倍视野）

注：与NT 组比较，＊P＜0.05；与6 h、12 h组比较，△P＜0.05；与12 h组比较，▲P＜0.05。

指标 SO 组 NT 组 HT3 h组 HT6 h组 HT12 h组Bcl－2阳性细胞数 2.40±1.14 21.60±5.94 43.20±5.81＊△ 35.10±4.31＊▲ 29.40±7.58＊

3 讨 论

脑缺血后神经元的死亡有坏死和凋亡两种，细胞凋亡参与缺血后梗死的发展。脑缺血后缺血中心区的神经元以坏死为主，缺血边缘区即半暗带区神经元则以凋亡为主。因此脑梗死后治疗的一系列措施主要是针对缺血半暗带进行的。亚低温能够缩小梗死面积、减轻脑水肿和改善缺血症状等，这些作用均可起到抑制神经元凋亡、阻止脑缺血后梗死灶进展的作用。

Bax是一种促凋亡蛋白，它表达增加可以促进细胞凋亡。Bcl－2是抗凋亡蛋白。二者存在于线粒体外膜、核膜和内质网膜上，可以形成不同的二聚体，通过它们之间的不同比例来调节线粒体膜的通透性，最终调节细胞的凋亡或存活。本研究结果显示，脑缺血后Bcl－2和Bax表达均上调。Bcl－2／Bax比值下降，凋亡细胞数增加［11］，促进Bcl－2表达、抑制Bax表达可使Bcl－2／Bax比值增加，凋亡细胞数减少，起到脑保护作用［12～14］。

文献报道，亚低温可使缺血脑组织的Bax表达上调和Bcl－2表达下调，发挥脑保护作用［13～15］。本实验发现Bax表达阳性细胞多位于缺血半暗带区，亦即缺血坏死区和正常脑组织的交界区域，证实Bax参与缺血后细胞凋亡。本实验结果显示，亚低温各组Bax表达阳性细胞数均明显少于常温组，说明亚低温治疗可使Bax的表达下调，提示亚低温治疗可能抑制或延缓了细胞凋亡。

亚低温各组Bcl－2表达阳性细胞数均明显多于常温组，说明亚低温治疗使Bcl－2 表达上调而抑制凋亡。Bcl－2和Bax蛋白含量的比值决定细胞凋亡过程的发生，凋亡的神经元会同时出现Bax表达升高和Bcl－2表达降低［16，17］，随着缺血时间的延长如果没有新的刺激因素作用，Bcl－2表达降低，Bcl－2阳性细胞数减少。有实验发现亚低温治疗12h、6h、3h组Bcl－2表达阳性细胞数呈递增趋势，说明早期亚低温治疗可抑制缺血半暗带区细胞的凋亡，延缓脑梗死进一步发展。

本实验结果显示，亚低温组缺血3h、6h和12h的梗死体积百分比依次增加，而亚低温各组在相应时间点与常温组比较梗死体积百分比均明显缩小。说明脑缺血后早期亚低温治疗可缩小梗死体积的扩大。由此可以推测亚低温治疗可能延缓了脑梗死的进展，减轻缺血性脑损伤，也就是延长了临床治疗的时间窗。

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