拟南芥β-罗勒烯合成酶基因 T-DNA插入突变体的鉴定

马泉芳,魏 然,刘春林

(湖南农业大学农学院,长沙 410128)

β-罗勒烯 (β-ocimene)是近年来发现的 ,与植物防御相关的植物通讯 (plant-communication)信号分子[1],在自然界中包括两个同分异构体:顺式-β-罗勒烯 (cis-β-ocimene) 和 反 式-β-罗 勒 烯 (trans-βocimene)。 β-罗勒烯是一种单萜 (monoterpenes)化合物。单萜是 C10类萜类化合物,由两个异戊二烯结构单元组成,以链状、环状及其衍生物的形式广泛存在于植物挥发油和树脂中[2,3]。这类产物在植物的种群竞争、吸引昆虫传粉、植食性昆虫防御等方面发挥着重要作用[4～6]。

研究发现,植物在受到外界的胁迫后,植株能释放出VOCs(volatile organic compounds),VOCs中含有一系列小分子的萜类化合物[7,8]。现在已经了解到许多植物种类如:玉米、棉花、利玛豆、马铃薯、烟草、拟南芥、番茄、地中海松、三叶草、月桃叶、黄瓜等等被节肢食草动物取食后,其叶片释放的有机挥发物中都包含反式 -β -罗勒烯[7～10]。 已有研究结果表明 ,反式 -β-罗勒烯能激发与受害植株相邻的植株产生诱导性防御反应并改变相邻植物体内的代谢途径,对病原微生物产生抗性或对食草动物产生驱赶作用[11～16]。刘春林等[17]以拟南芥为材料,分别选择水杨酸信号传导途径启动的指示基因 PR1与茉莉酸信号传导途径的指示基因PDF1.2基因片段为探针,运用 Northern杂交的方法已经发现β-罗勒烯能诱导完整植物中与水杨酸和茉莉酸有关防御基因的表达,而且发现β-罗勒烯能解除水杨酸和茉莉酸的拮抗作用。这表明β-罗勒烯是一种与植物防御启动密切相关的信号分子。

β-罗勒烯这种单萜挥发性有机物是由萜类合成酶(terpeniod synthase,T PS)催化合成的。萜类合酶类,以氨基酸序列相似度 40%为基准将其分为 TPS-a～T PS-g 7个亚家族[18,19],它主要包括单萜合成酶(monoterpene synthase)、倍半萜合成酶(sesquiterpene synthase)和二萜合成酶 (diterpene synthase)。除直链的多聚萜类 (如橡胶)外,大多数萜类化合物都具有环状结构。单萜合酶分布于 TPS-b,T PS-d,TPS-f和 TPS-g 4个亚家族。单萜合酶基因表达受生物钟调节,表达量随昼夜周期交替变换而出现高低变化。如金鱼草月桂烯合酶、罗勒烯合酶,拟南芥月桂烯合酶、罗勒烯合酶基因的表达量和产物都呈现午后高、夜间低的昼夜交替规律[20,21]。

Aubourg等(2002)通过对拟南芥基因的序列分析发现拟南芥含有40个 TPS类似基因,并将这 40个相似基因组成的家族命名为 At TPS家族。At TPS03(Arabidopsis thaliana terpenoid synthase 03)基因是At TPS基因家族中的一员。 Jenny等人[22]通过cDNA克隆,鉴定了一个基因 At TPS03,它能编码单萜合酶,这种单萜合酶能高特异性催化香叶基二磷酸生成β-罗勒烯。

为了研究β-罗勒烯的功能,需要获得 At TPS03基因沉默的纯合突变体。纯合体的获得将为进一步研究At TPS03基因在植物防御、植物通讯方面的作用奠定良好的基础。本实验所用材料是从美国拟南芥生物资源中心订购 AtT PS03基因的 T-DNA插入突变体材料 CS879103,通过 PCR检测对其基因型进行鉴定,获得了8株稳定的纯合突变体株系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

At TPS03基因 T-DNA插入突变体 CS8791039(T4代)种子购自美国俄亥俄州立大学 ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center),野生型拟南芥(Col-0生态型)种子由本实验室保存。

1.1.2 生物学试剂

2×Taq MasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司,100 bp plus Marker购自北京全式金生物技术有限公司,Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自 Fermentas公司,引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 材料培养

先将种子消毒,然后散播于盛有蛭石的小钵内,置于4℃恒温黑暗培养室内春化48h;春化后转入人工生长室中培养,环境条件为:恒温22～24℃,光照强度为120～150μ mol/m2· s(1μ mol/m2· s=53.8 Lux),16 h光照 /8 h黑暗,相对湿度 75%,定时浇营养液。待其生长至 25 d左右时,取幼嫩叶用于 DNA分离。

1.2.2 单株植物总DNA提取

取拟南芥幼叶 2～3片于 1.5 mL离心管中,研棒研碎,至 65℃水浴锅中水浴 15 min,加 2×CTAB DNA提取液 600μL和等体积氯仿∶异戊醇(24∶1),在涡漩器上混匀,14 000 rpm离心 7 min;取上清液至一新的 1.5 mL离心管中,加2倍体积无水乙醇,同时加上清液 1/10体积的 3 mol/L NaAC轻轻颠倒混匀(-20℃放置 20 min),14 000 rpm离心 10 min,吹干,溶于灭菌的超纯水中后作为 PCR扩增的DNA模板。

1.2.3 DN A的 PCR扩增

PCR反应体系。反应体系为15μL:模板2μL,2×Taq MasterMix 7.5μL,正向引物 F 0.1μ L,反向引物R 0.1μL,用 ddH2O补足至 15μL。

PCR反应条件。 (1)预变性,94℃,3 min;(2)变性 ,94℃ ,40 s;(3)退火 ,62℃ ,35 s,72℃延伸 45 s(从变性至延伸 35个循环);(4)最后延伸,72℃,7 min。反应结束 16℃保存。

1.2.4 PCR产物的检测

检测 PCR产物一般利用 1.6%的琼脂糖凝胶进行电泳,其中电泳缓冲液为 1× T AE,电压为 5 V/cm,用EB进行染色,PCR产物上样量为 8μL,电泳结果用本实验室的凝胶成像系统拍照记录。

1.2.5 PCR引物的设计

每个T-DNA单株基因型的鉴定需要3条引物,分别是:LP,位于基因组上距离 T-DNA插入位点左断臂600 bp;RP,位于距离 T-DNA插入位点右臂端 300 bp;T-DNA左断臂引物 LB3(表1)。 PCR引物设计参照(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2html.)相关资料。

1.2.6 纯合突变体中模板基因表达的 RT-PCR验证

待纯合突变体生长至 32 d时,取 2株已被初步鉴定为纯合子的植株和 1株野生型(Col-0),用剪刀在其莲座叶上剪一刀,其中对每株纯合子剪创2片,8 h后取样,液氮速冻后,用 Trizol法提取RNA,用Fermentas公司的 Revert AidTM First Strand cDN A Synthesis Kit进行反转录得到 cDNA,然后对这 3株材料的At TPS03进行半定量RT-PCR分析,其中所用引物见表1。 PCR反应条件为 94℃预变 3 min,94℃50 s,61℃退火 40 s,72℃延伸 50 s,最后延伸 72℃ 8 min,16℃保存,扩增 35个循环。以基因 Actin2为对照。

表1 PCR扩增所用的引物及其序列Table 1 Primer sequences used for the PCRamplification

2 结果与分析

2.1 PCR引物设计

原理如图1所示。当用 LP和 RP这对引物进行PCR检测时,在野生型植株(wild type,WT)和杂合子(heterozygous lines,HZ)植株中产生一条 PCR产物带,分子量大约是 900 bp,而纯合子 (homozygous lines,HM)植株中没有 PCR产物形成;当用 RP和 LB3这对引物 PCR检测时,在野生型植株中没有 PCR产物,而在杂合子植株和纯合子植株中均有一条 PCR产物带,分子量大小为 410+Nbp。

图1 PCR引物设计原理a.PCR引物设计示意图;b.电泳结果示意图。来自http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2htmlFig.1 Principles of primer design of PCRa.Schematic diagram of primer design of PCR;B.Schematic diagram of Electrophoresis results

2.2 T-DNA插入位点鉴定结果

T-DNA突变体材料长至 25 d时,取 4株,提取基因组 DNA作为模板进行 PCR扩增,以一株野生型植株基因组 DNA作为对照模板。当分别用 LP、RP和RP、LB3这两对引物进行 PCR扩增时,根据电泳结果(图2)可判断,除了作为对照的 1号泳道,其他相邻的两个泳道中,当有两条分子量分别为 900 bp和 410+Nbp的 PCR产物时,说明该植株在该位点有 T-DNA插入,而且是杂合子植株(如 2和 3,6和 7号泳道 );当只有一条分子量为410+Nbp的 PCR产物时,说明该植株在该位点有 T-DNA插入,而且是纯合子植株(如4和5,8和9号泳道)。通过PCR扩增和电泳结果分析,最后得到2株纯合子植株,分单株收集种子。

待 T-DNA插入纯合突变体材料长至 30 d时(图3),其株型比 Col-0野生型小,抽薹早于 Col型。

2.3 纯合子RT-PCR检测

图2 电泳结果Fig.2 Electrophoresis results

将已初步鉴定的 2株纯合突变体与 1株野生型Col-0(图3),用剪刀对莲座叶进行剪创伤处理,8 h后,分别提取总 RNA,对分离的RNA进行 RT-PCR检测,结果(图4)显示 2株纯合突变体没有扩增产物,而野生型 Col-0有带,说明 AtTPS03基因的表达因 T-DNA插入而被完全沉默了。 T-DNA插入位点的鉴定结果与 RT-PCR两方面的结果证实鉴定的 T-DNA插入纯合突变体可以用于下一步的 AtT PS03基因对植物生长发育方面的研究。

图3 a:Col-0野生型;b:T-DNA插入的纯合子:2号 (为泳道中的 4和 5)和 3号(为泳道中的 8和 9)Fig.3 a:Columbia-0type;b:T-DNA insertion homozygous mutants:2(lane4,5)and3(lane8,9)

图4 T-DNA插入纯合子体内AtTPS03基因的表达情况Fig.4 AtTPS03gene expression of T-DNA insertion homozygous mutants

待 T-DNA插入纯合突变体材料长至50 d时(图5),与 Col-0型相比,T-DNA插入纯合子其株型变小,叶片有的轻微泛黄,果荚变短,茎秆变细,成熟期早于 Col-0型。

3 讨 论

图5 a:Col-0野生型;b:T-DNA插入的纯合子:2号和 3号Fig.5 a:Columbia-0type;b:T-DNA insertion homozygous mutants 2and 3

对 T-DNA插入突变体的鉴定,引物的设计一般是直接利用http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2html网页提供的软件。本实验也是根据T AIR官方网站公布的基因 AT 4G16740.1的 T-DNA插入位置,找到其突变体的类型,搜索到检测所需的3条引物,对突变体进行检测,检测结果小于 1 000 bp,与理论值1 044 bp有些出入,比网站上公布的结果小。

双引物法检测获得的 T-DNA插入纯合突变体,一定要对其进行基因表达分析。因为从理论上讲,TDNA插入的片段比较大,插入突变往往使基因处于沉默状态,大多数实验结果也证实这一理论。但是有时也会遇到,尽管是纯合插入突变体,但是目标基因还是能够表达。笔者实验时就遇到过一次:得到的纯合 TDNA插入突变体,插入位点是在基因的信号肽序列上,RT-PCR检测结果却发现该基因能够转录获得有功能的 cDNA。

在相同培养条件下,发现 AtTPS03基因纯合突变体与野生型Col-0的形态有差异。突变体株型变小,莲座叶叶片泛黄,出现提前衰老现象;侧枝数目少,茎秆变细,花型变小,果荚变短;成熟期早于 Col-0型。这种现象表明,AtT PS03基因可能参与调控植物的生长发育。所以本实验获得的 AtTPS03基因纯合突变体为进一步研究β-罗勒烯的功能奠定了良好基础。

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