荧光原位杂交技术在膀胱尿路上皮肿瘤病理学诊断中的初步应用

陈顺平 刘 伟 余英豪 刘苏英 陈 霓 谢飞来

尿路上皮癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，且容易复发，遗传学研究表明尿路上皮癌容易发生染色体畸变［1］。现今，随着遗传学在临床方面的广泛应用，尿路上皮肿瘤遗传学改变正逐渐成为临床病理诊断的关注焦点，而FISH作为临床常用的遗传学检测技术，可直接用于检测细胞核染色体的改变［2］。目前在膀胱肿瘤方面研究较多是通过检测尿液细胞学染色体改变情况，以判断膀胱尿路上皮癌的存在与复发，而对于组织学方面研究较少。本文应用FISH技术，对膀胱不同级别尿路上皮乳头状瘤样病变组织进行检测，了解3、7、17号染色体及p16基因在这些病变中的非整倍性情况，以期对膀胱尿路上皮肿瘤的病理学诊断及鉴别诊断提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2009年1月～2010年12月、在南京军区福州总医院手术切除或膀胱镜活检的膀胱肿瘤石蜡包埋组织标本33例，其中男性16例，女性17例，年龄32～75岁，平均48.5岁。按不同乳头状瘤样病变类型分为5组:腺性膀胱炎6例(B组)，内翻性乳头状瘤6例(C组)，低度恶性潜能的乳头状尿路上皮肿瘤7例(D组)，非浸润性膀胱乳头状尿路上皮癌5例(E组)，浸润性膀胱尿路上皮癌9例(F组)。以10例正常膀胱黏膜组织作为对照组(A组)。

1.2 主要仪器和试剂

酸性亚硫酸钠为美国Simga产品，蛋白酶K为美国罗氏产品，探针(GLP9P16、CSP3、CSP7、CSP17 探针)购自北京金菩嘉公司。Olympus BX51型荧光显微镜、Dake原位杂交仪、电热恒温水槽、隔水式恒温培养箱等。

1.3 FISH检测方法

主要步骤如下:①石蜡组织切片3 μm，置于涂胶玻片上并浸于二甲苯中脱蜡至水;②50℃下30%酸性亚硫酸钠处理组织切片30～40 min;③室温下2×SSC漂洗3 min×2次;④组织上滴加自行配制的即用型蛋白酶K，37℃预热的孵育盒中消化25～35 min;⑤室温下2×SSC漂洗3 min×2次，乙醇梯度脱水固定，自然干燥;⑥避光环境下杂交区域滴加探针混合液(7 μl杂交缓冲液、1 μl去离子水和 2 μl探针)，83℃自动杂交仪中变性6 min后置37℃过夜杂交。⑦洗涤:移去盖玻片，46℃下2×SSC漂洗10 min×2次，0.1%NP-40溶液中5 min。待玻片干燥后加DAPI复染液，置暗盒中复染数分钟。OLYMPUS BX51荧光显微镜DAPI/FIFC/RHOD三色滤光镜下观察期间细胞荧光杂交信号。

1.4 结果判定

①信号判断:由1名医师和1名技术员共同观察记录结果。每例分析100个散在细胞，以细胞杂交率＞80%为有效标本，细胞重叠、破损及杂交信号微弱细胞核不计数，细胞内杂交信号互相靠近者计为1个信号。确定单个细胞染色体异常的标准为:单个细胞信号数≥3为扩增;≤1为信号缺失。②阈值建立:阈值=平均数(M)+3个标准差(SD)，以正常组为标准建立域值如下:CSP3≥7个异常细胞为扩增;CSP7≥8个异常细胞为扩增;CSP17≥6个异常细胞为扩增;p16≥6个异常细胞为扩增。p16基因≥70个细胞信号缺失为基因缺失。

1.5 统计学分析

应用SPSS17.0软件进行统计学分析，采用样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组病例3、7、17染色体及p16扩增率与缺失率

浸润性尿路上皮癌(F组)与其他各组(A～E组)3、7、17染色体及p16扩增率和缺失率比较，均有统计学意义(P均＜0.01);其他各组间比较无统计学意义(P ＞0.05)，见表1。

2.2 各组病例4种探针联合检测的异常情况

4种探针联合检测≥2个指标异常出现率，浸润性尿路上皮癌(F组)为100.00%，低度恶性潜能乳头状尿路上皮肿瘤(D组)为14.29%，非浸润性乳头状尿路上皮癌(E组)为20.00%，F组与其他5组比较均有统计学意义(P均＜0.01)，见表1。

表1 各组膀胱组织多基因检测结果(例，%)

2.3 扩增或缺失病例信号差异分析

9例浸润性膀胱尿路上皮癌中，3、7、17染色体均为非整倍性扩增，扩增率为100.00%(9/9)，且染色体非整倍性情况具有多样性;信号点数较为密集，提示高扩增。低度恶性潜能乳头状尿路上皮肿瘤和非浸润性膀胱尿路上皮癌染色体仅各1例出现染色体异常，而且为低扩增或p16基因部分缺失。

2.4 FISH技术检测判断恶性尿路上皮肿瘤的敏感性与特异性

≥2个指标异常浸润性尿路上皮癌诊断敏感性为81.82%，特异性为91.67%;≥2个指标异常非浸润性尿路上皮癌诊断敏感性为9.10%，特异性为64.29%。

3 讨论

尿路上皮癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，复发率高达70%，在初诊时大部分为非浸润性癌，即使经过切除肿瘤联合化疗药物或卡介苗膀胱灌注治疗后，仍有30% ～40%的患者复发［3］，10% ～15%的复发性非浸润性尿路上皮癌会进展为浸润性癌或转移性癌［4］。因此，对膀胱肿瘤的早期诊断以及对术后复发的监测非常重要，许多研究者都把目光投向分子遗传学方面，而FISH技术是现今最常应用于尿路上皮癌诊断的分子遗传学研究方法之一，该方法具有很高的灵敏性及特异性，直观性和重复性好，2001年7月被FDA批准用于膀胱肿瘤的检测，其主要用于染色体数目和结构畸变的研究。Sandberg等［5］在1994年对泌尿肿瘤染色体研究认为，尿路上皮癌易发生染色体改变，其中包括结构畸变和染色体数目异常，常见结构畸变染色体有3、9、1、5、11、21、17 号染色体，染色体数异常见于 3、9、7、10、11、Y、1、8、17、15 号染色体。目前临床上用于诊断尿路上皮癌的常用染色体主要有:3、7、9、17号染色体。此外，尿路上皮癌的发展与染色体不稳定性也紧密相关，特别是3、7 及17 号染色体的非整倍性［4，6］。目前国内外有关FISH技术应用于膀胱尿路上皮肿瘤的大规模的临床应用研究，都局限于尿路上皮癌的尿液细胞学检测，而应用于膀胱尿路上皮肿瘤不同病变期组织学染色体改变情况的研究尚未见报道。鉴于不同类型膀胱尿路上皮肿瘤病变，特别是乳头状增生性病变在日常病理诊断中既多见，而有时又难以很好把握，特别是个别病例在同一张切片中会同时见到良性乳头状增生至浸润性癌的改变，因此，我们应用FISH技术，对不同类型的膀胱尿路上皮肿瘤组织进行FISH检测，一方面初步了解染色体在膀胱尿路上皮肿瘤组织学中的非整倍性情况，同时希望对膀胱尿路上皮肿瘤的日常病理诊断及鉴别诊断提供帮助。

本研究选用3、7、17号染色体和9号染色体部的p16基因这4种特异性DNA探针，对33例膀胱尿路上皮肿瘤组织、10例正常对照膀胱组织进行FISH检测，通过检测染色体的遗传学改变，来评估FISH技术在膀胱尿路上皮肿瘤病理诊断中的作用。结果发现，3、7、17染色体及p16扩增率与缺失率方面，浸润性尿路上皮癌组与其他各组差异均有统计学意义;其他各组(A～E组)间差异无统计学意义;4种探针联合检测中有≥2个指标同时出现异常，浸润性尿路上皮癌(F组)占100.00%、低度恶性潜能的乳头状尿路上皮肿瘤(D组)为14.29%、非浸润性乳头状尿路上皮癌(E组)为20.00%，F组与其他各组差异有统计学意义;≥2个指标同时异常诊断浸润性尿路上皮癌敏感性为81.82%、特异性为91.67%，这与FISH应用于细胞学方面报道结果相近［7～9］;但是≥2个指标异常诊断非浸润性乳头状尿路上皮癌敏感性低，仅20%出现基因异常改变。通过进一步分析，我们发现，不同程度不同染色体的非整倍性及p16基因扩增及缺失存在与不同分期的尿路上皮肿瘤中，如低度恶性潜能组及内翻性乳头状瘤组亦出现基因异常病例。但随着组织病变级别的增高，染色体非整倍性更具多样性，信号点类型表现更为复杂且扩增率更高，而达到浸润性癌时，3、7、17染色体均为非整倍性扩增，扩增率达100%，这与Bollmann等［10］的研究结果相近。

由此我们认为:①膀胱乳头状尿路上皮病变出现染色体非整倍性扩增，且非整倍性情况具多样性;信号点密集几乎均见于浸润性尿路上皮癌;②不同类型的膀胱乳头状尿路上皮病变，均可能出现不同程度不同染色体的非整倍性及p16基因扩增及缺失，但良性及非浸润性癌非整倍性的多样性及信号点类型复杂程度较低;③即使没有出现染色体非整倍性扩增的病例，亦不能排除膀胱尿路上皮癌的诊断，而一旦出现FISH阳性改变亦给予高度重视，及时进行必要的干预或密切随访;④这4组探针联合检测，可用于尿路上皮癌术后病例的监测，但并不能作为早期癌的敏感筛查方法。

由于本研究病例数相对偏少，特别是几例病理组织学显示良性病变而出现基因异常的病例，目前临床意义尚不明确，我们将进行密切的随访，同时有必要进行尿液脱落细胞学FISH检测与病理组织学对比的大宗病例对照研究。

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