固相萃取-离子对色谱法测定酱油与黄豆酱中的三聚氰胺

支晓芳，李晓敏，戴新华，弓爱君，*，方 向

（1.北京科技大学应用科学学院，北京100083；2.中国计量科学研究院，北京100013）

固相萃取-离子对色谱法测定酱油与黄豆酱中的三聚氰胺

支晓芳1，李晓敏2，戴新华2，弓爱君1，*，方 向2

（1.北京科技大学应用科学学院，北京100083；2.中国计量科学研究院，北京100013）

建立了固相萃取-离子对色谱法测定酱油与黄豆酱中的三聚氰胺。样品经甲醇提取，Waters MCX固相萃取柱净化。分析时用Inertsill ODS-SP C18色谱柱（5μm，4.6×250mm）分离。水（缓冲液：0.01moL/L柠檬酸+0.01moL/L辛烷磺酸钠，pH=3.0）∶乙腈=92∶8（V/V）溶液为流动相，流速1.0mL/min，在紫外波长240nm下检测。三聚氰胺在0.02～2.00mg/L的范围内，有良好的线性关系（r2=0.9999），方法检出限为1.0mg/kg，加标回收率在83.5%～109.3%范围内，相对标准偏差小于5.0%。

三聚氰胺，酱油，黄豆酱，固相萃取，离子对色谱

三聚氰胺（melamine）简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，分子式为C3N6H6，是一种重要的氮杂环有机化工原料，具有肾毒性。三聚氰胺非法添加的根本原因是由于目前乳制品、豆制品等食品中蛋白含量检测采用的凯氏定氮法，是通过测量样品中总氮（包括蛋白氮和非蛋白氮）折算为蛋白含量，不能区分这种伪蛋白氮，给非法添加非蛋白质氮带来可乘之机。因此，如何快速、准确地分析食品中的三聚氰胺成为食品企业、食品监管机构和广大民众密切关注的问题。文献报道的三聚氰胺的检测方法有 HPLC法、HPLC-MS/MS法、GC-MS［1-4］法，但酱油与黄豆酱中三聚氰胺的检测尚未见报道。酱油和黄豆酱系大豆制品，是我国传统的、广泛使用的调味品，它们的成分比较复杂，除食盐外，还有氨基酸、糖类、有机酸、色素及香料等成分，尤其是酱油和黄豆酱含有大量的色素及蛋白，在进行液相色谱分离前，必须进行前处理才能避免基质的干扰，同时延长色谱柱的使用寿命。由于三聚氰胺是强极性化合物，在传统的C18反相柱上保留很差，因此，需在流动相中加入离子对试剂以改善其色谱保留行为。本文采用乙腈和0.01moL/L柠檬酸和辛烷磺酸钠组成的离子对缓冲液为流动相，样品用混合型阳离子固相萃取柱净化，能很好地富集目标物，并与其它干扰物达到基线分离，回收率良好。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

三聚氰胺标准品 纯度≥99.6%，扩展不确定度0.5%，中国计量科学研究院研制；甲醇、乙腈 均为色谱纯，美国TEDIA公司；辛烷磺酸钠、柠檬酸 纯度≥99%，Alfa Aesar公司；氨水 分析纯，北京化工厂；乙酸 分析纯，比利时ACROS公司；水 超纯水，Milli-Pore超纯水器制备。

LC-20AT液相色谱 DAD检测器SPD-M20A、四元泵，岛津公司；美国Waters MCX固相萃取柱500mg，6mL；CP324S分析天平 德国Sartorius公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：Inertsill ODS-SP C18色谱柱（5μm，4.6× 250mm）；流动相：A为100%乙腈，B为离子对缓冲液（由0.01moL/L柠檬酸及辛烷磺酸钠组成，pH为3.0），乙腈∶离子对缓冲液 =92∶8（V/V）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：240nm；进样量：20μL。此条件下三聚氰胺标准品溶液HPLC色谱图如图1。

图1 三聚氰胺标准品溶液HPLC色谱图

1.3 样品前处理

1.3.1 酱油提取 称取5g（精确至0.01g）试样于50mL具塞塑料离心管中，加入40mL甲醇，剧烈振荡提取6～7min，加水定容至满刻度，充分混匀后静置10min，4000r/min离心10min（4℃），上清液待净化。

1.3.2 黄豆酱提取 称取30g（精确至0.01g）试样于小烧杯中，加入20g水（精确至0.01g），用均质器匀浆15min。称取5g（精确至0.01g）匀浆后的式样于50mL具塞塑料离心管中，加入5mL水（70℃），充分混匀，超声提取6min，加入30mL甲醇，再剧烈振荡提取6～7min，加水定容至满刻度，充分混匀后静置10min，8000r/min离心10min（4℃），上清液待净化。

1.3.3 净化 用Waters MXC固相萃取柱（500mg，6mL）净化。先依次用3mL甲醇、3mL水预处理固相萃取小柱，分别吸取“1.3.1”和“1.3.2”中的待净化液5mL过柱，控制流速0.5～1mL/min，再依次用3mL水、3mL甲醇洗涤SPE小柱，弃去所有流出液，抽干，用体积分数5%的NH3·H2O甲醇溶液5mL洗脱，抽干。洗脱液中加乙酸0.3mL，用水定容至6mL，充分混匀，静置15min，过0.22μm滤膜，进样测定。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的选择

三聚氰胺的强极性和碱性决定了其提取溶剂一般都选用极性较强的有机溶剂、缓冲溶液、有机溶剂与水的混合溶液等，如甲醇、己烷磺酸钠缓冲液、乙腈+水溶液、甲醇+水溶液、稀盐酸溶液等。同时由于酱油和黄豆酱中含有大量的蛋白，ODS液相色谱柱不适合直接分析含有生物大分子（如蛋白质之类）的样品，因此在进行提取时要加入蛋白质沉淀剂去除蛋白质。常用的蛋白沉淀剂有乙腈、三氯乙酸、甲醇、醋酸铅、醋酸锌、亚铁氰化钾等。本实验尝试使用乙腈和甲醇进行三聚氰胺的提取和去除蛋白，并进行了比较。

乙腈沉淀：通过实验发现沉淀析出较少，而且酱油中含有大量的油脂，在沉淀酱油样品中的蛋白时，有明显的分层现象，取下层酱油相（加标样品）用乙腈二次萃取后，进样测定，发现二次萃取液与一次萃取液中的目标物出峰一致，峰高、峰面积相近，说明乙腈提取分层后的下层酱油相也含有三聚氰胺。进样检测所得色谱图杂质峰也较多，因此乙腈沉淀并不适用。

甲醇沉淀：经甲醇沉淀后，样品无分层现象，沉淀较多，且样品进入色谱柱杂质含量较少，回收率也良好。

通过比较上述两种沉淀蛋白方法的效果，最终确定用甲醇作为三聚氰胺的提取溶剂和蛋白沉淀剂，同时也避免了对毒性较大的乙腈的使用。

2.2 净化条件的选择

酱油与黄豆酱样品，基质组成十分复杂，含有大量具有紫外吸收的物质，例如有机酸、氨基酸、醛类及酯类等，这些物质可能会与待测组分三聚氰胺出峰时间相同而干扰三聚氰胺的检测。尤其酱油中含有大量色素，若不经过净化处理，则干扰强，色谱基线不稳定，不利于样品检测，而且还会影响色谱柱寿命。因此要对样品中的分析物作预分离和富集后才能用高效液相色谱测定。

三聚氰胺呈弱碱性（弱阳离子化合物），所以本实验采用Waters MCX固相萃取柱净化，Waters MCX固相萃取柱能保留碱性化合物，有效地去除样品中的杂质。三聚氰胺有三个氨基，有较强的极性，可以选择极性较强的有机溶剂将其洗脱。综合以上因素，本实验采用体积分数为5%的NH3·H2O甲醇溶液作为洗脱液，并对使用60、150、500mg三种不同容量填料的固相萃取小柱的加标回收率结果进行了比较，结果如图2所示。

由图2可以看出，采用60mg和150mg填料的MCX固相萃取小柱，三聚氰胺大部分都被损失了，回收率分别只有约19%和48%，产生过载现象。使用500mg填料小柱，回收率约95%，因此选用500mg填料小柱，采用体积分数为5%的NH3·H2O甲醇溶液作为洗脱液。

2.3 色谱条件的选择

本实验尝试使用SCX阳离子交换色谱柱和C18反相色谱柱对三聚氰胺进行分析，比较结果如下：

图2 SPE柱容量对回收率的影响

SCX阳离子交换色谱柱：最初流动相选用0.05mol/L KH2PO4（pH=3）缓冲液与乙腈，发现存在严重干扰，调节乙腈比例从30%到10%，干扰物对乙腈比例不太敏感，30%乙腈条件下目标峰出现处存在大量干扰物，在10%乙腈比例条件下目标峰与所有干扰物一起出现，提高乙腈比例无改善。更换为甲醇后，调节甲醇比例从10%到90%，目标峰与前后干扰物均无法完全基线分离，加标回收率约55%。

C18反相色谱柱：由于三聚氰胺是强极性化合物，在传统的C18反相柱上保留效果不佳，因此，在流动相中加入离子对试剂以改善其色谱保留行为。本文采用乙腈和0.01mol/L柠檬酸和辛烷磺酸钠组成的离子对缓冲液（pH=3）为流动相。最初选取90%的缓冲液比例，三聚氰胺在13min出峰，与前面的干扰峰刚好基线分离，但重复实验发现缓冲液浓度与pH的微小差别会使三聚氰胺与前面干扰峰不能完全分离。增大缓冲液比例到95%，三聚氰胺的出峰时间为28min，虽然能与前干扰峰完全分离，但保留时间太长。最后选取缓冲液比例为92%，在此条件下三聚氰胺在17min出峰，且与前面干扰峰能完全基线分离。

本实验最后选用C18反相色谱柱，流动相为92%的0.01mol/L柠檬酸和辛烷磺酸钠组成的离子对缓冲液（pH=3）：8%乙腈溶液（V∶V），酱油与黄豆酱出峰情况相似，此条件下分析物与干扰物能很好地分离，不受缓冲液浓度与pH微小差别的影响。酱油与黄豆酱添加三聚氰胺时的HPLC色谱图如图3所示。

图3 酱油与黄豆酱加标样品的HPLC色谱图

2.4 线性范围、检出限及回收率

配制质量浓度为0.02，0.10，0.20，0.50，2.00mg/L的三聚氰胺系列标准溶液，按照“1.2”的色谱条件进样检测，并以标准品质量浓度（x，mg/L）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标作图，同时用最小二乘法进行线性回归，得三聚氰胺的标准曲线如图4所示。曲线回归方程为Y=74109x-1287，相关系数为r2=0.9999，说明在0.02～2.00mg/L范围内，标准品质量浓度与峰面积有很好的线性关系。本方法检出限为1.0mg/kg。

图4 三聚氰胺的标准曲线

对8份酱油样品和8份黄豆酱样品进行加标回收实验，对酱油样品，分别加入三聚氰胺标准溶液0.670、0.400、0.170、0.083mg/L四个浓度水平；对黄豆酱样品，分别加入三聚氰胺标准溶液0.400、0.240、0.100、0.050mg/L四个浓度水平；每个加标浓度均做六个平行样，按“1.3”样品处理方法进行处理，测定三聚氰胺含量，计算回收率。结果如表1所示，其回收率均在83.5%～109.3%之间，RSD小于5.0%，重现性良好。

表1 方法回收率及精密度测定结果（n=6）

3 结论

本研究建立了酱油与黄豆酱中三聚氰胺的检测方法。利用甲醇沉淀样品中的蛋白并提取三聚氰胺，MCX固相萃取柱净化去除基质干扰，方法简单快速，可以作为调味品中三聚氰胺检测的参考方法。

［1］李建华，何强，孔祥虹，等.固相萃取-离子交换色谱法测定植物提取物中的三聚氰胺［J］.分析实验室，2008，27（10）：93-95.

［2］赵永彪，李自春，刘婷，等.高效液相色谱法测定宠物食品中的三聚氰胺［J］.分析实验室，2008，27（1）：190-192.

［3］Wendy C A，Sherri B T，Christine M K，et al.Determination of Melamine Residues in Catfish Tissue by Triple Quadrupole LCMS-MS with HILIC Chromatography［J］.Laboratory Information Bulletin，2007，23：4396.

［4］Yokley R A，Mayer L C，Rezaaiyan R.Analytical method for the Determination of Cyromazine and Melamine Residues in Soil Using LC-UV and GC-MSD［J］.J Agric Food Chem，2000，48：3352-3358.

Determination of melamine in sauce and bean-sauce with solid phase extraction and ion pair chromatography

ZHI Xiao-fang1，LI Xiao-min2，DAI Xin-hua2，GONG Ai-jun1，*，FANG Xiang2
（1.School of Applide Science，University of Science and Technology Beijing，Beijing 100083，China；2.National Institute Metrology P.R.China，Beijing 100013，China）

A method was developed for the determination of melamine in sauce and bean-sauce with solid phase extraction and ion pair chromatography.Samples were extracted with methanol and purified by Waters MCX solid phase extraction column.Chromatographic analysis was performed on a lnertsill ODS-SP C18column（5μm，4.6× 250mm）with 0.01mol/L+0.01mol/L citric acid buffer（pH=3）-acetonitrile（92∶8）as mobile phase and detected at 240nm.The presented method showed good linear relationship（r2=0.9999）for melamine in the range of 0.02～2.00mg/L.The detection limit was 1.0mg/kg，and the recoveries ranged from 83.5%to 109.3%with relative standard deviation less than 5.0%.The method is fast，accurate，simple for melamine analysis.

melamine；sauce；bean-sauce；solid phase extraction；ion pair chromatography

TS207.3

A

1002-0306（2011）02-0333-03

2009-10-26 *通讯联系人

支晓芳（1982-），女，硕士研究生，研究方向：分析化学。

国家自然科学基金（NSFC20627004）；创新方法工作专项项目（2008IM040200）；北京市教委产学研项目。