罗望子多糖硫酸酯的制备及表征

高义霞，杨 声，周向军，张 继，2，*，张 花

（1.天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741001；2.西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州730070）

罗望子多糖硫酸酯的制备及表征

高义霞1，杨 声1，周向军1，张 继1，2，*，张 花1

（1.天水师范学院生命科学与化学学院，甘肃天水741001；2.西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州730070）

利用水提醇沉、Sevage法及木瓜蛋白酶法从食品级的罗望子胶中分离、纯化罗望子多糖，得到的罗望子多糖纯度为92.7%。采用氯磺酸-吡啶法合成罗望子多糖硫酸酯，元素分析法测得其取代度为1.4；红外表征发现硫在合成产物中以S=O双键和C-O-S形式存在。

罗望子，硫酸化多糖，红外光谱，元素分析

多糖硫酸酯是多糖大分子链中单糖分子链上的某种羟基被硫酸根所取代而形成的一类化学结构复杂、生物活性多样、构效关系鲜明的多糖衍生物。近年来发现硫酸酯化多糖具有多种生物活性，如增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒等［1］。天然的硫酸多糖主要来源于动物、植物、微生物的不同组织中，但其种类和含量少。1988年，日本学者Mizumoto等人首次将硫酸基团引入到一些均多糖结构中，发现硫酸化多糖能抑制T淋巴细胞病毒，至此，硫酸化成为多糖结构修饰中的一个重要方面［2］。为了提高多糖的生物活性，可通过硫酸化修饰等方法对其进行结构改造，获取更多的多糖硫酸酯。罗望子胶是豆科罗望子属植物（Tamarindus indica L.）果实中的果核胚乳部分，易分散于冷水中，加热则形成粘稠状液体［3］。通常约含有15%～22%的蛋白质，0.7%～8%粗纤维，4%～7%油脂，2%～3%灰分及65%～72%左右的多糖。其多糖主要是由D-半乳糖、D-木糖、D-葡萄糖（1∶3∶4）组成的中性聚多糖，除多糖外，还有少量游离的L-阿拉伯糖。罗望子多糖的分子结构中，主链为β-D-1，4-连接的葡萄糖，侧链是α-D-1，6-连接的木糖和β-D-1，2-连接的半乳糖，由此构成了支链极多的多糖类物质［4］。罗望子多糖有良好的耐热、耐盐、耐酸、耐冷冻和解冻性，具有稳定、乳化、增稠、凝结、保水、成膜的作用，其水溶液的粘稠性较强，黏度不受酸类和盐类等的影响［5-6］。近年来研究发现，罗望子多糖是葡聚木糖，它是一种理想的膳食纤维来源，可起到防治高血压的作用，另外，还可增加小肠非扰动层的厚度，减弱糖类物质的吸收，防止糖尿病的发生发展，具有无明显毒副作用以及应用过量不致产生低血糖等特性。但由于罗望子多糖粘度较高，影响了其在体内的吸收，进而影响了其活性作用，因此制备罗望子多糖硫酸酯，改变其物理特性，增加其生物活性，意义重大。本研究对罗望子多糖进行硫酸酯化研究并利用红外光谱扫描、元素分析等方法对酯化多糖进行表征，为后续的药理研究奠定理论基础。硫酸酯化的方法很多，常用方法包括：浓硫酸法、三氧化硫-吡啶法、氯磺酸-吡啶法、氯磺酸-甲酰胺法等［7］，有研究发现氯磺酸-吡啶法操作简单、反应条件温和、产物回收容易、收率较高，是硫酸化多糖较为理想的一种方法［8］。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗望子胶 食品级，甘肃省弘诺科技贸易有限公司；氯磺酸、吡啶、二甲基甲酰胺 均为国产分析纯。

PLPHR 1-4LD真空冷冻干燥机，NOCOLET FT-IR360，Elementar Analysensysteme GmbH，722可见分光光度计等。

1.2 实验方法

1.2.1 罗望子多糖制备 准确称取罗望子胶10g，溶胀于1000mL水中，80℃水浴提取2h。4层纱布过滤，弃滤渣，滤液离心后，上清液浓缩至200mL，加入4倍量75%乙醇4℃沉淀过夜，离心，沉淀冷冻干燥至恒重得粗多糖。取上述粗多糖，以固液比1∶100（m/v）加入蒸馏水于70℃水浴中溶解，用Sevage+木瓜蛋白酶法除蛋白［9］，上清液依次用流水和蒸馏水各透析1d（用1%AgNO3检测蒸馏水透析后的袋内及袋外物无白色沉淀生成），透析后的糖液浓缩至原体积的1/4倍后，加入乙醇使其浓度达到75%～80%，置4℃冰箱过夜，离心分离，收集沉淀并依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤两次，冷冻干燥至恒重，得罗望子多糖。

1.2.2 多糖含量的测定 利用蒽酮硫酸法［10］对上述制备的罗望子多糖含量进行测定。分别取0.1g/L的葡萄糖溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL，用蒸馏水补到1.00mL；分别加入4.00mL蒽酮试剂，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新沸腾起，准确煮沸10min取出，用自来水冷却，室温放置10min左右，于620nm比色。以同样处理的重蒸馏水为空白，进行比色。以光密度为纵坐标，糖的含量（μg/mL）为横坐标，得标准曲线。取40μg/mL罗望子多糖溶液1.00mL，加入蒽酮试剂，同标准曲线操作，比色测定，根据标准曲线和样品浓度计算含量。

1.2.3 罗望子多糖硫酸酯的制备

1.2.3.1 酯化试剂的制备 将附有冷凝、搅拌和恒压漏斗装置的反应器置于0℃冰盐浴中，加入24mL预冷的无水吡啶到三颈烧瓶中，搅拌使之充分冷却。打开恒压漏斗的活塞，再将约4mL氯磺酸30min内逐滴加入，见烧瓶中出现大量淡黄色固体，停止反应，-20℃保存备用［11］。

1.2.3.2 酯化反应 称取0.5g上述制备的罗望子多糖加入到约15mL的二甲基甲酰胺（DMF）中，超声处理20min后，加入盛有上述酯化试剂的三颈烧瓶中，立即将其移入沸水浴，密封，恒温磁力搅拌反应2h。取出三颈烧瓶，冷却至0℃，用0℃的2.5mol/mL的氢氧化钠中和pH至中性，加入3倍体积无水乙醇，析出沉淀，过夜离心收集沉淀，并将沉淀用适量水溶解，用自来水透析2d，蒸馏水透析1d。袋内物浓缩，冷冻干燥，得罗望子多糖硫酸酯。

1.2.4 罗望子多糖硫酸酯的鉴定

1.2.4.1 红外光谱分析 采用溴化钾压片法对硫酸基进行定性分析。

1.2.4.2 元素分析法 利用元素分析法测定硫酸酯化多糖中碳、氢、氮及硫含量，并计算取代度。取代度公式：DS=（1.62×S%）/（32-1.02×S%），其中，DS为取代度，S%为硫的百分含量。

2 结果与分析

2.1 罗望子多糖含量测定

取40μg/mL罗望子多糖水溶液，以上述制作标准曲线方法测定其吸光度为0.228，由回归方程可计算出，纯化的罗望子多糖纯度为92.7%。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 红外光谱分析

罗望子多糖及其硫酸酯红外光谱见图2，可知罗望子多糖在3436.04cm-1处有一强而宽的峰，是分子键氢键缔合的羟基O-H的伸缩振动产生的，它是多糖的特征吸收峰；而经硫酸化修饰后，可看出此处的峰移向3438.20cm-1，并且峰变窄变弱，表明由于硫酸基的取代，改变了局部的空间位置情况，使得羟基参与分子氢键的状态发生了变化，有利于提高多糖的水溶性。峰高度的削弱表明硫酸基发生了取代，使羟基的数量减少。硫酸酯化后的多糖峰中1262.78、821.04cm-1是硫酸基的特征吸收。1262.78cm-1处的峰是O-SO3-的S=O双键的伸缩振动，821.04cm-1峰是C-O-S的伸缩振动。

图2 罗望子多糖及其硫酸酯红外光谱

2.3 元素分析

由表1可知，经元素分析，硫酸化罗望子多糖及其硫酸酯含氮量都为0，表明它们都不含有蛋白质；硫酸化后，S的含量达14.7%，由取代度公式计算出其取代度为1.4。

表1 N、H、C、S元素分析结果

3 结论

本研究利用氯磺酸-吡啶法合成罗望子多糖硫酸酯，元素分析法检测含硫量可计算出取代度为1.4；利用红外光谱表征可知，硫在合成产物中以S= O双键和C-O-S形式存在。对罗望子多糖硫酸酯化的修饰，旨在生产成本低廉、产物量大、生物学活性高、应用广泛的罗望子硫酸多糖，为罗望子的深度开发和其在医药方面的应用提供参考。

［1］田龙.猕猴桃果水溶性多糖硫酸酯的制备及抗氧化活性［J］.华中农业大学学报：自然科学版，2007，26（4）：570-573.

［2］向道斌，李晓玉.硫酸化多糖：一类治疗AIDS的新药［J］.国外医药药学分册，1992，19（1）：1-5.

［3］詹晓北.食用胶的生产、性能与应用［M］.北京：中国轻工业出版社，2003：199-227.

［4］蒲彪，邓继尧，蒋华曾，等.罗望子果肉的营养成分分析［J］.四川农业大学学报，1994（4）：455-457.

［5］胡国华.功能性食品胶［M］.北京：化学工业出版社，2004：50-59.

［6］周家华.食品添加剂［M］.北京：化学工业出版社，2001.

［7］栗衍华，谭成玉，王秀武，等.硫酸化多糖的制备及其生物活性的研究进展［J］.精细与专用化学，2006，21（8）：6-9.

［8］徐文清.硫酸酯化多糖研究的新进展［J］.天津药学，2002，14（6）：1-4.

［9］张继，高义霞，武光朋，等.沙蒿多糖的提取、纯化工艺研究［J］.食品科学，2007，28（5）：125-127.

［10］张惟杰.糖复合物生化研究技术［M］.第二版.浙江：浙江大学出版社，1994：12-13.

［11］杨铁虹，贾敏，商澎，等.当归硫酸酯的合成及其对脾细胞增值的作用［J］.第四军医大学学报，2001（5）：432-434.

Preparation and characterization of sulfated tamarind polysaccharide

GAO Yi-xia1，YANG Sheng1，ZHOU Xiang-jun1，ZHANG Ji1，2，*，ZHANG Hua1
（1.College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，China；2.College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China）

A water-soluble polysaccharide was extracted from tamarind seed gum by method of boiling water and ethanol deposition.The crude polysaccharide was deproteined by Sevage combined with papain.The content of polysaccharides was 92.7%.Tamarind seed polysaccharides were sulfated by chlorosulfonic-pyridine methods，and its substitution degree was 1.4 measured by methods of elemental analysis.lR characterization showed that sulfur existed in the title products in the form of S=O and C-O-S.

Tamarindus indica L.；sulfated polysaccharide；lR；elemental analysis

TS201.1

A

1002-0306（2011）02-0142-03

2010-01-25 *通讯联系人

高义霞（1982-），女，助教，研究方向：资源植物学。