嗜虫书虱β-ACTIN基因克隆及定量PCR方法的建立

2011-11-14 07:15:46唐培安王进军
中国粮油学报 2011年11期
关键词:内参克隆定量

唐培安 王进军 宋 伟

(南京财经大学食品科学与工程学院1,南京 210003)

(西南大学重庆市昆虫学及害虫控制工程重点实验室2,重庆 400716)

嗜虫书虱β-ACTIN基因克隆及定量PCR方法的建立

唐培安1王进军2宋 伟1

(南京财经大学食品科学与工程学院1,南京 210003)

(西南大学重庆市昆虫学及害虫控制工程重点实验室2,重庆 400716)

旨在建立嗜虫书虱的实时荧光定量PCR分析方法,为嗜虫书虱基因的定量分析提供技术支持。利用RT-PCR方法,从嗜虫书虱体内克隆获得了β-actin基因cDNA片段(GenBank登录号:FJ041117),该基因片段长度为822 bp,编码273个氨基酸残基(从第3个碱基开始编码)。根据此β-actin基因的序列设计引物,建立了基于SYBR Green I染料技术的实时荧光定量PCR方法。建立的嗜虫书虱β-actin实时荧光定量PCR法扩增效率高、检测范围广、检测周期短,为β-actin作为内参基因进行嗜虫书虱功能基因的定量分析奠定了基础。

嗜虫书虱 β-actin基因 实时荧光定量PCR 内参基因

实时荧光定量 PCR(quantitative real-time PCR)是20世纪90年代发展起来的一种准确、快速的核酸定量分析技术,是研究基因表达水平最为有用的方法之一[1-2]。实时荧光定量PCR分绝对定量和相对定量,在相对定量检测中,需要一个内部参照基因,即“内参基因”或称“看家基因”,对目标基因表达量进行校正,以期获得真实可靠的结果[3]。内参基因有很多种,常用的有 β -actin、28S rRNA、18S rRNA、GAPDH 和 α -tubulin 等[4-5]。其中,β -actin是构成细胞骨架的主要成分——肌动蛋白的一种,以往的研究结果表明,β-actin具有基因序列高度保守、mRNA表达量高且稳定的特点,常作为内参基因被广泛应用[6-7]。

储粮害虫可造成粮食数量和质量的巨大损失,是威胁我国粮食安全的重要因素[8]。嗜虫书虱(Liposcelis entomophila Enderlein)隶属于啮目(Psocoptera)、书虱科(Liposcelididae),是一种世界性储粮害虫,我国大部分地区都有嗜虫书虱的分布,通常跟嗜卷书虱、无色书虱和小眼书虱等混合发生[9-10]。自20世纪90年代以来,我国储粮中书虱类害虫发生越来越严重,在粮库中经常暴发成灾,对粮食安全造成很大的威胁[11-12]。近年来,随着科技水平的不断进步,对书虱等储粮害虫的研究已进入分子生物学领域[13]。然而,通过搜索 GenBank等数据库,未发现可用作嗜虫书虱基因定量分析的内参基因,也未见关于嗜虫书虱实时荧光定量PCR方法的报道。因此,本研究首先利用RT-PCR方法克隆获得了嗜虫书虱β-actin基因cDNA片段,并以此为内参基因建立了实时荧光定量PCR方法,对嗜虫书虱相关功能基因表达分析研究提供有用的方法学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试书虱

嗜虫书虱1992年采自重庆市北碚区粮库,在实验室(27±1)℃、75% ±5%RH、不予光照、不接受任何药剂的条件下以全麦粉、酵母粉和脱脂奶粉(10∶1∶1)混合而成的饲料饲养。

1.1.2 主要仪器和试剂

Mx3000PTM实时荧光定量PCR仪、Brilliant SYBR Green QPCR Master mix:美国Agilent Stratagene公司;MastercyclerⓇPCR仪:德国Eppendorf公司;TRIzol试剂:美国invitrogen公司;PrimeScriptTMRT-PCR Kit、Taq DNA聚合酶、pMD18-T vector:TaKaRa公司;Gel Extraction Mini Kit:上海华舜生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据已报道的其它物种的β-actin氨基酸序列用DNAMAN软件进行多重比对,找出保守序列,并据此保守序列设计简并引物:

上游引物:5'-GNCARAARGAYWSNTAYGTNGG-3'下游引物:5'-GNGCNARNGCNGTDATYTCYTT-3'根据试验中克隆获得的嗜虫书虱β-actin基因片段,使用Primer 3.0在线引物设计软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)设计 real- time PCR 引物,其序列如下:上游引物:5'-CTTGACGGAGCGTGGTTATT-3'下游引物:5'-ACCGATGGTGATTACTTGACC-3'

1.2.2 总RNA的提取与反转录

用TRIzol试剂从嗜虫书虱体内提取总RNA,所有操作按试剂盒说明书进行;cDNA合成按Prime-ScriptTMRT-PCR Kit说明书进行。

1.2.3 PCR反应及其产物的克隆与测序

利用上述简并引物PCR扩增后,产物经琼脂糖凝胶电泳,EB染色,利用胶回收试剂盒对目的电泳条带进行回收纯化,纯化产物克隆到pMD18-T质粒载体中,用通用引物进行序列测定,所有测序工作由上海英俊生物公司完成。

1.2.4 序列分析

多重序列比对和氨基酸序列的推导使用DNAMAN软件完成,BLAST同源性搜索在美国国家生物技术信息中心(NCBI)站点完成。

1.2.5 实时荧光定量PCR条件的优化

采用SYBR Green I染料法,在Mx3000PTM实时荧光定量PCR仪上进行扩增和数据分析,以最小的Ct值和最高的荧光值为标准,分别对循环条件、退火温度、引物浓度进行优化。

1.2.6 熔解曲线分析

为排除形成二聚体及非特异性扩增产物对实时荧光定量PCR结果造成影响的可能性,在PCR后进行熔解曲线分析,以确定得到的产物为单一的目的产物。温度以0.5℃/10 s的速度从60℃缓慢递增到95℃,连续测定样品的荧光强度以获取熔解曲线。

1.2.7 标准品的制备及标准曲线的建立

以总RNA反转录的cDNA为模板,利用上述定量PCR引物对嗜虫书虱β-actin基因进行常规PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳后,EB染色,利用胶回收试剂盒对目的电泳条带进行回收纯化。对纯化的目的片段进行5倍系列稀释,以优化的反应条件进行实时荧光定量 PCR,以相对拷贝数的对数为横坐标,以Ct值为纵坐标建立相对定量标准曲线。

2 结果与分析

2.1 嗜虫书虱β-actin基因cDNA片段的克隆及序列分析

图1 嗜虫书虱β-actin基因片段核苷酸序列及其推导的氨基酸序列

图2 嗜虫书虱与其它昆虫β-actin基因片段核苷酸序列的多重比对

以抽提的嗜虫书虱总RNA为模板,用反转录试剂盒进行cDNA的合成,用设计的简并引物进行扩增,获得了一条约为820bp的基因片段,经酶切和PCR鉴定后进行基因序列测定,得到嗜虫书虱βactin基因 cDNA的片段(GenBank登录号:FJ 041117)。该基因片段长度为822 bp,编码273个氨基酸残基(从第3个碱基开始编码),其核苷酸序列及推导的氨基酸序列见图1。将嗜虫书虱β-actin基因的核苷酸序列进行BLAST搜索比对,发现嗜虫书虱β-actin基因与其他昆虫的β-actin具有很高的同源性,它与小眼书虱(Liposcelis paeta,GQ449384)、嗜卷书虱(Liposcelis bostrychophila,FJ196622)、埃及伊蚊(Aedes aegypti,DQ440059)、家 蚕 (Bombyx mori,HQ918291)、白纹伊蚊(Aedes albopictus,DQ657949)、美国牧草盲蝽(Lygus Lineolaris,DQ386914)的β-ac-tin同源性分别高达89%、88%、83%、83%、83%和84%,表明该基因在不同物种间具有高度的保守性(图2)。

2.2 标准品的制备及标准曲线

PCR产物经回收纯化后作为标准品,进行5倍系列稀释,采用优化的条件进行实时荧光定量PCR,以Ct值为纵坐标,以相对拷贝数的对数为横坐标,获得相对定量标准曲线(图3),结果表明,本方法有很好的相关性,其 Ct值与模板浓度的回归方程为Y= -1.426Log(x)+21.42,Y 为 Ct值,x为模板浓度,其相关系数为0.989,扩增效率为97.5%。

图3 β-actin基因的标准曲线

2.3 熔解曲线

扩增产物的熔解曲线只有一个特异峰,表明产物是唯一的,无引物二聚体和非特异性扩增产物,说明本实验设计的定量PCR引物具有很好的特异性,PCR反应条件得到了较好的优化。

图4 熔解曲线分析

3 讨论与结论

近年来,书虱作为一类重要的储粮害虫引起科学家们的重视,对其研究也逐步深入到分子生物学领域[13]。Tang等从嗜虫书虱体内克隆获得了2条乙酰胆碱酯酶基因(AChE)[14];Jiang等从嗜卷书虱体内克隆获得了2条多功能氧化酶基因(P450),并利用实时荧光定量PCR方法比较了2条基因在不同虫态之间的转录水平[15];Wu等[16]从小眼书虱体内克隆获得了1条乙酰胆碱酯酶基因(AChE),利用实时荧光定量PCR方法比较不同地理品系之间的转录水平,研究其分子水平的多态性。采用实时荧光定量PCR技术可以比较昆虫不同品系、不同组织或不同个体间基因表达的差异,从分子水平上揭示害虫抗药性产生机理,以此建立抗药性分子诊断技术,还可以针对变化了的分子结构设计特定的靶标杀虫剂,为有害生物的综合治理提供技术支撑[17-20]。然而,目前尚未见到有关嗜虫书虱内参基因的研究报道。为了给嗜虫书虱基因表达的定量分析提供必要的方法手段,本研究克隆获得了嗜虫书虱β-actin基因cDNA片段,并以此为内参基因建立了基于SYBR Green染料技术的嗜虫书虱实时荧光定量PCR方法。结果表明,利用嗜虫书虱β-actin基因(GenBank登录号:FJ041117)为内参基因,利用本研究设计的定量PCR引物所建立的方法具有快速(从RNA提取到PCR结束在4 h内完成)、高通量(一次可同时检测90多个样本)、线性范围广以及重复性强等特点,从而为β-actin作为内参基因对嗜虫书虱相关基因的实时荧光定量PCR分析提供了有利的方法学基础。

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Cloning of β-actin Gene and Establishment of Quantitative Real-time PCR from Liposcelis Entomophila

Tang Peian1Wang Jinjun2Song Wei1

(School of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance and Economics1,Nanjing 210003)

(Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering of Chongqing,Southwest University2,Chongqing 400716)

The purpose of this study was to establish a quantitative real-time PCR method for Liposcelis entomophila and provide useful methodological basis for quantitative analysis of L.entomophila genes.The sequence of the β-actin gene cDNA fragment of Liposcelis entomophila was amplified by reverse transcript polymerase chain reaction(RT-PCR),which contained 822 base pairs(bp)and encoded 273 amino acid(GenBank accession number:FJ041117).According to the sequence of β -actin gene above,a quantitative real-time PCR method based on SYBR Green I dye was developed.The results showed that the quantitative real-time PCR method established in the study had the advantages of high efficiency,wide linear range and less time.The results of this study might provide a basis for β - actin used as a reference gene to analyze the Liposcelis entomophila gene quantitatively.

Liposcelis entomophila,β-actin,quantitative real-time PCR,reference gene

Q786

A

1003-0174(2011)11-0071-05

时间:2011-10-25 10:17

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2864.TS.20111025.1017.002.html

CNKI:11 -2864/TS.20111025.1017.002

国家自然科学基金(31000828)

2011-01-18

唐培安,男,1981年出生,讲师,储藏物昆虫学

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