环链拟青霉固体培养基优化的研究

李丰伯,程 遥,胡 凯,董晓娟,方乐金

（1.黄山学院生命与环境科学学院,安徽黄山245021;2.黄山市科技局,安徽黄山 245021）

环链拟青霉固体培养基优化的研究

李丰伯1,程 遥2,胡 凯1,董晓娟1,方乐金1

（1.黄山学院生命与环境科学学院,安徽黄山245021;2.黄山市科技局,安徽黄山 245021）

本文通过固体培养环链拟青霉环链实验得出:添加了三种土样及啤酒糟、谷壳、锯末的固体培养基具有不同的产孢子和菌丝生长效果。筛选出三个最佳配方,从添加的三类土样后的固体培养基产孢子效果上来看,塘泥土>菜园土>污泥土。本实验培养方法模拟了野外环境,在降低本菌株大规模培养的生产成本,便于推广应用和进一步的研究开发的方向上做了部分探讨。

环链拟青霉;固体培养

环链拟青霉[Paecilomycescateniannulatus]是一种重要的昆虫病原真菌,主要用于温室害虫生物防治。环链拟青霉对蚜虫和菜青虫有较好的防治效果[1]。其孢子的萌发温度在35℃以下,对温血动物特别是哺乳动物较为安全,国内外对环链拟青霉的生物学、分类、生化和应用的研究很少[2]。本研究进行了该菌的固体发酵优化的研究,了解利用食品、农业副产物固体培养的特性,以期将该菌研发为有自主知识产权微生物杀虫剂。

以工业化大生产为目的的实验室实验,原材料的成本问题不能被忽视,而单纯以玉米渣、小米、麦麸为原料的三级固体培养,成本高、产孢量低,而且造成大量原料的浪费[3]。特别是,微生物杀虫剂存在着培养周期长,见效较慢,受环境影响较大,农民受科学文化素质较低的影响,推广较为困难等方面的制约。为此本着就地取材,适应安徽本地实际,经济实用的出发点,农民易于操作,原材料来源广配方的思路,按不同比例进行三级固体培养料的配方试验方式,筛选出合理培养料配合比例,尽量使用农业副产物,降低生产成本。

在目前的机械农业、白色农业中害虫猖獗,害虫益虫的比例严重失调的大环境下,本课题研究的生物防治菌环链拟青霉具有生长速度较快,抑制其他杂菌的生长,对蚜虫、菜青虫、白粉虱等害虫的致病性较高的优势,故使用此菌进行以菌治虫的生物防治,不仅可以降低农作物生产成本,提高农业产品的市场竞争力,降低农作物残留毒性,还可以改善环境,维护生态平衡。故此菌有较好的应用前景,有进一步研究开发的价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

环链拟青霉[Paecilomycescateniannulatus]x-1,采自云南西双版纳勐腊西山,保藏于黄山学院微生物实验室。

1.1.2 培养基

一级斜面菌种培养基:PSA培养基。

二级液体摇瓶培养基:啤酒糟5%,蔗糖1%,豆饼粉0.5%,磷酸二氢钾0.02%,豆油0.05%,硫酸镁0.02%,尿素0.1%。

三级固体培养料按不同比例配置而成（表1）,固体培养料分为4类。

第1类（ABCD）以谷壳和啤酒糟加三种土配方

第2类（EFGH）以啤酒糟、谷壳和锯末加三种土配方

第3类（IJKL）以豆渣粉、谷壳加三种土配方

第4类（MNO）以谷壳加三种土配方

李顺过来说，六如叔，你怎么这么拧呢，社区开发那是乡里开会订下的，你那个合同也不顶事。再说，还是人家佟老板救了你，你总不能恩将仇报吧。

1.2 方法

1.2.1 一级斜面菌种培养

采用PSA培养基斜面培养（SEA,1977）[4]

1.2.2 固体培养基配置方法

取回土样,在恒温箱中60℃烘干,粉碎,灭菌。按固体培养料配方配好,加水量以用手握住有水滴渗出而松手后又不结成团为好,装到罐头瓶中,各瓶装入量疏松度和高度一致,以便保持相同的供气量,提高干燥箱温度至40-45 ℃,烘干 ,取出 ,称重。[5]

1.2.3 固体料发酵方法

1.2.4 孢子含量的测定

用1/10000精度电子天平称取1g菌粉,放入500ml三角瓶中加无菌水100ml,震荡用玻璃珠10粒,用手摇匀,然后逐步稀释,用血球计数板测定孢子含量。

产孢量=平均每小格孢子数×400×10000×稀释倍数

表1 固体培养料配方

1.2.5 数据处理

采用单因素分组完全随机设计试验,采用LSD测验法做多重比较。

2 结果与分析

采用最佳液体接种量接种表1所有配方进行固体发酵,产孢量结果见表2。不同固体配方对产孢量的影响为以下几点:

（1）第4类配方没加啤酒糟或豆渣粉,营养物质不足或营养物质太单调,没有足够的C源、N源或其它微量元素,所以没有菌丝生长,没有孢子产生。只见少数孢子附着在培养料上。

（2）其他配方中第3类菌丝生长最好,培养基被包埋,颜色全部变白,菌丝生长茂密。从整体上来看孢子量是配方1最高,其次是配方3,再次是配方2。

（3）从每一个配方来看,配方B产孢量最高,其次为A和L。其产孢量分别为 185.4×109,167.1×109,和128.1×109个。这三个配方在本次试验中是最优配方。可以在产业化生产中作为有效配方用于扩大再生产。

（4）以三种土的利用情况来看:菌丝生长以污泥为最好,塘泥土其次。但就产孢量来看,以用塘泥土为最好,其次为菜园土,最差为污泥土。

表2 固体配方筛选试验

3 结论与讨论

（1）在实际实验操作的过程中,在选用最佳配方的基础上,应首先进行固体培养基接种量的优化,从而达到与预期值相仿的最高孢子产量。在固体配方筛选实验中,由本次试验结果可以得出配方A,B,L三种配方产孢量最高,但室内试验的数据应该与田间应用数据的对比上需要进一步扩大试验。

（2）通过本次试验,在环链拟青霉防治生物固体培养料中首次加入土成分,目的是降低生产成本,扩大培养料来源,为菌丝生长提供营养物质。为环链拟青霉生物防治菌的在安徽农业发达地区的普及及其推广应用打下基础,降低农民生物防治害虫所投入的资金。试验结果可看出在供试土样中,以生物防治菌的产孢量考虑,塘泥土的效果最好。

[1] 李丰伯,方乐金,郭丽敏.一株对桃芽有较高毒力的环链拟青霉菌株的固体培养条件的研究[J].安徽农学通报2008,14（23）:47-49.

[2] 刘爱英,梁宗琦,陈月碧.环链拟青霉和玫烟色拟青霉对菜青虫的致病条件的研究[J].贵州农业科学1982（1）:57-59.

[3] 王成树.真菌杀虫剂剂型的研究现状（综述）[J].安徽农业大学学报,1996,23（3）:375-380.

[4] SEA原著.张景欧等译.昆虫病理学原理[M].北京:科学出版社.1977:395-502.

[5] Uziel A Kennet h RG. Influence of commercially derived lipids and a surfactant on t he mode of germination and process of germ tube formation in primary conidia of two species of Erynia subgenus Neopandora[J ] . Mycopat hologia1998 , 144 (3) :153 - 163.

Q93-335

A

1673-1794（2011）02-0036-02

李丰伯（1979-）,男,硕士,讲师,从事微生物学方面研究。

安徽省优秀青年人才基金（2009SQRZ168）

2010-11-20