薏米及发芽薏米酶解抗氧化活性变化

李存芝，欧仕益，周 琪，晏日安，张 宁

（暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632）

薏米及发芽薏米酶解抗氧化活性变化

李存芝，欧仕益，周 琪，晏日安，张 宁

（暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632）

采用测还原力和抗DPPH自由基清除活性这两种体外实验方法，对薏米经中性蛋白酶酶解前后的抗氧化活性进行了比较，适宜的酶解条件为：温度40℃，时间5h。实验表明，发芽薏米比薏米的抗氧化活性有所提高，而蛋白酶酶解发芽薏米具有较高的抗氧化活性。将薏米及发芽薏米进行酶解处理，其产物的抗氧化活性由高到低排序为：发芽后酶解薏米，酶解薏米，发芽薏米，原薏米。研究为进一步分析研究薏米抗氧化物质提供基础数据，对薏米及发芽薏米功能食品开发起到促进作用。

薏米，抗氧化，酶解

薏米在我国一直是很有价值的药食兼用保健食品，日本、韩国及欧美等国家对薏米也尤其推崇，每年都从我国进口大量薏米，并且有薏米饮料等相关产品面世。薏米含丰富的营养成分，而且是中国传统中药，具有健脾、补肺、消炎、化湿利尿等功效，可减少患癌几率，被誉为“世界禾本科植物之王”。薏米的蛋白质含量高于大米，专家认为其保健功能毫不逊色于冬菇、灵芝［1］。近年来天然抗氧化食品由于特有的保健功能而受到更多的关注，天然产物抗氧化活性的研究对食品及医药工业都具有重要的意义［2-4］。本研究采用测还原力和抗DPPH自由基清除活性这两种体外实验方法，针对薏米及发芽薏米经过蛋白酶酶解前后抗氧化活性的变化进行分析研究，旨在为进一步开发安全绿色的营养保健和抗氧化食品提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

薏米 市售；中性蛋白酶 广州裕立宝生物科技有限公司提供；DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl） Sigma公司，紫色结晶；混合磷酸盐缓冲溶液 pH6.6；铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁等其他试剂 均为分析纯。

HH-4恒温水浴 江苏金坛宏华仪器厂；721型分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；HC-2518离心机 科大创新有限公司中佳分公司。

1.2 实验方法

1.2.1 薏米、发芽薏米粉的制备及薏米蛋白酶酶解的工艺路线

1.2.1.1 薏米粉制备 薏米用粉粹机粉碎，得到薏米粉，40℃烘箱干燥5h，冷藏保存。

1.2.1.2 发芽薏米粉制备 取浸泡好的薏米于30℃恒温培养箱内萌发26h，然后将发芽薏米置于50℃的烘箱中干燥24h，粉碎成粉待用。

1.2.1.3 薏米蛋白酶解工艺流程 将薏米粉（或发芽薏米粉）与适量的0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH6.6）混合，配制成浓度为40%的薏米溶液，加入蛋白酶，充分混合，再于一定温度水浴下振荡水解。水解结束后，立即100℃灭活酶。冷却后4000r/min离心10min，取上清液待测定。

1.2.2 薏米DPPH自由基清除能力的测定［6］二苯基苦味肼基自由基［DPPH·］是一种稳定的以氮为中心的自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，乙醇溶液呈紫色，并且在517nm波长处有最大吸收，其浓度与吸光度呈线性关系。当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对，其颜色变浅。在最大吸收波长处的吸光值变小，且这种颜色的变浅程度与配对电子数成化学计量关系。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。

取不同浓度的薏米酶解溶液或未经酶解的薏米溶液2mL，加入0.025g/L DPPH甲醇溶液2mL，经混合后在室温下避光反应30min，517nm处测定吸光度Ai；同时测定DPPH甲醇溶液（2mL）+甲醇（2mL）的吸光度A0和样品溶液（2mL）+甲醇（2mL）的吸光度Aj。按下式计算DPPH自由基清除率，DPPH自由基清除率越高，即抗氧化活性越高。

1.2.3 薏米还原能力测定［3，8］还原力的测定是用来评价抗氧化剂活性的常用方法。还原力强的样品应该是良好的电子供应者，它供应的电子不仅能使Fe3+还原为Fe2+，也可以与自由基反应。

取一定浓度的薏米酶解溶液或薏米非酶解溶液1mL，加入0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（pH6.88）2.5mL和1%的铁氰化钾溶液2.5mL，充分混合后，在50℃下保温20min，然后加入10%的三氯乙酸，经充分混合后以3000r/min离心10min。取上清液2.5mL，加入蒸馏水2.5mL和0.1%FeCl30.5mL，测定反应液在700nm处的吸光度值。吸光度值越大，即OD值越大，表示还原力越强。

2 结果与讨论

2.1 薏米酶解温度对还原性的影响

本实验采用中性蛋白酶对未经发芽的薏米进行水解，其使用温度范围是 35～55℃，使用 pH是6.0～7.5。所以用混合磷酸盐缓冲溶液（pH6.6）配制浓度为40%的薏米粉溶液（即4g薏米粉+6g缓冲溶液），加入中性蛋白酶，并分别在35、40、45、50、55℃的水浴温度下对薏米粉进行振荡水解3h。再经灭活、离心后，上清液用作还原性测定［8］。

如图1可知，在以上水解温度区间中，酶解产物的还原力随着酶解温度的升高先上升然后下降。40℃时的OD值最大，说明薏米在40℃的温度下水解产物具有最大的还原力。随着温度的升高，体系内能随之增大，反应速度加快，随着温度的不断升高，高于蛋白酶的最适温度时，酶逐渐变性。40℃时，本实验蛋白酶具有最高的酶解活性，可将蛋白质水解得较为充分，形成的多肽具有较强的还原力；而当温度再增加，不仅酶的活性会降低，又会对蛋白质的营养活性造成一定损失。所以实验的水解温度定为40℃，以获得具有较大抗氧化活性的水解产物。

图1 酶解温度对还原性OD值的影响

2.2 薏米酶解时间对 DPPH自由基清除能力的影响

将40%的未经发芽的薏米粉缓冲溶液样品在40℃水浴温度下进行振荡水解，水解时间分别为1、2、3、4、5、6h，水解后立即灭活酶，离心，上清液用作DPPH自由基清除能力测定。

由图2可知，薏米蛋白酶水解产物的DPPH自由基清除能力随时间的延长而增大，到5h时清除率达到最大，即抗氧化活性最强，同时表明水解时间与抗氧化活性并不呈线性关系，这与贾薇［3］的结果相符合。实验表明不是水解越充分，抗氧化能力越强，而是只有在特定的水解度下，形成特定的结构，水解物才具有较大的抗氧化能力。Je J Y［4］和 Anne Pihlanto［2］的研究结果也表明，水解物的抗氧化活性与多肽的氨基酸序列有关。由图1、图2可知，薏米水解时间5h，水解温度40℃可以获得具有较高抗氧化活性的水解产物。

图2 酶解时间对DPPH自由基清除能力的影响

2.3 不同浓度下薏米和酶解薏米抗氧化活性的比较

未经发芽的薏米按照酶解温度40℃，时间5h的条件进行酶解后，与原薏米配制成不同浓度的溶液，进行还原性和清除DPPH自由基的测定。

由图3可知，随着薏米浓度的增加，吸光度值逐渐增大，酶解薏米和非酶解薏米的还原能力不断增强，呈一定的线性关系，并且酶解薏米的还原力显著高于非酶解薏米。

图3 不同浓度下酶解薏米与原薏米还原力OD值的比较

图4 酶解薏米和原薏米在不同浓度下自由基清除率的比较

图4表明，酶解薏米对DPPH自由基有明显的清除作用，其对DPPH自由基的清除能力与浓度呈一定的线性关系：随着酶解薏米浓度的增加，其捕获清除的DPPH自由基也越多。在一定的浓度之下，酶解薏米的DPPH自由基清除率大大高于非酶解的薏米。还原性测定和消除DPPH自由基能力测定，这两种方法共同证实了酶解薏米的抗氧化活性远远高于原薏米。相关分析认为，肽的抗氧化活性与其肽段中含有的疏水性氨基酸有关［4］。薏米蛋白中的多肽链紧密折叠，疏水氨基酸残基在其内部形成疏水区域，蛋白质表面被亲水外壳所包裹，许多抗氧化氨基酸残基被包埋于蛋白分子内部，不利于与自由基产生作用，影响了其抗氧化效果的发挥［7］。在酶解过程中，原来包埋于分子内部的抗氧化氨基酸残基显露出来，释放出具有抗氧化活性的小分子肽和游离氨基酸，薏米蛋白酶酶解物抗氧化活性高于未酶解的薏米，这为进一步研究薏米抗氧化物质的结构和机理，制备具有更强抗氧化性的薏米保健品提供了基础数据。

2.4 薏米、酶解薏米、发芽薏米及发芽后酶解薏米抗氧化活性的比较

发芽薏米的氨基酸含量明显高于未发芽的薏米，氨基酸总量增加95%以上［10］，薏米发芽1d后，磨成粉进行干燥。参照上述薏米及酶解薏米的还原性及清除DPPH自由基能力测定方法，进行发芽薏米和酶解发芽薏米的还原性及清除DPPH自由基能力测定。

还原力测定的吸光值越大，表示还原力越强。如图5可知，发芽后再酶解的薏米有最大的OD值，即最强的还原力，其次是酶解薏米、发芽薏米和原薏米。

图5 不同处理方式的薏米在同一浓度下的还原力OD值

由图6可知，各样品清除DPPH自由基的能力即抗氧化活性由高到低排列依次为：发芽后酶解薏米、酶解薏米、发芽薏米、原薏米，这与还原力测定的结果相符。

发芽后酶解薏米具有最高的抗氧化活性的原因可能是，薏米在发芽过程中，会引起维生素C和其他生理活性物质的生化变化，增加其抗氧化活性。同时，内源蛋白酶将自身的蛋白质水解，肽键断裂，已经形成了具有抗氧化活性的多肽。这些多肽和其他未经内源酶水解的蛋白质再经过外源酶水解，就增加了更多的抗氧化肽，相比之下，具有较高的抗氧化活性。

图6 不同处理方式的薏米在同一浓度下的自由基清除率

3 结论

3.1 薏米经不同方法进行处理，其产物的抗氧化活性由高到低排序依次为：发芽后酶解薏米、酶解薏米、发芽薏米、原薏米。

3.2 薏米经蛋白酶酶解均表现出明显高于原薏米的还原力和清除自由基活性，并随着浓度的升高而升高。

3.3 中性蛋白酶酶解薏米获得抗氧化活性的适宜条件是：40℃的水解温度和5h的水解时间。水解时间与抗氧化活性不呈线性关系。

最近市场上有韩国的米类饮料面世，价格相对来讲比较贵，国内也有一些大米饮料方面的研究，但是在市场上还很少见到产品。薏米的蛋白、脂类含量都超过大米，且药食兼用，目前新加坡、日本等都很推崇薏米食品，薏米产品的开发具有积极的意义。实验中采用薏米及发芽薏米为原料，通过蛋白酶酶解，形成抗氧化性的肽类，同时其他营养成分得以保留，增强了薏米的功能保健效果，制备过程仅采用酶制剂，安全可靠，为开发具有抗氧化性薏米保健食品具有一定的现实意义。

［1］刘媛媛.药食兼用之薏苡仁［J］.食品与健康，2007（1）：28.

［2］Anne Pihlanto.Ant oxidative peptide derived from milk proteins［J］.International Dairy Journal，2006，11（16）：1306 -1314.

［3］贾薇，于国萍，孟宪金.大米蛋白酶水解物的抗氧化活性研究［J］.食品科技，2008（9）：150-152.

［4］Je J Y，Park PJ，Kim SK.Antioxidant activity of a peptide isolated from Alaska Pollack frame protein hydrolysate［J］.Food Research International，2005，38：45-50.

［5］金融.大米蛋白酶解物抗氧化作用研究［D］.南京农林大学硕士学位论文，2006.

［6］郭亚力，李聪，欧灵澄，等.3种分光光度法对天然抗氧化物质抗自由基性能的分析检测［J］.分析实验室，2004（10）：43-48.

［7］欧仕益，张璟.酶解麦麸产品抗氧化活性研究［J］.食品与机械，2005（11）：17-19.

［8］王遂，张亚丽，尤旭.玉米种皮中蛋白质水解特性的研究［J］.中国粮油学报，2000（2）：20-22.

［9］回瑞华，侯冬岩，邢晓燕，等.不同产地稻米抗氧化性能的比较［J］.食品科学，2007（8）：62-64.

［10］吴传茂，吴周和，石勇.从必需氨基酸看发芽薏苡饮料的营养价值［J］.氨基酸和生物资源，1998，20（3）：58-59.

Study on change of antioxidant of adlay power before and after enzymolysis

LI Cun-zhi，OU Shi-yi，ZHOU Qi，YAN Ri-an，ZHANG Ning
（Department of Food Science&Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

The adlay was enzymolysised and it’s antioxidant power was examined by two indicators，which were the anti-DPPH free radical scavenging activity and the reducibility.This study found the suitable hydrolysis condition was：40℃，5h.ln this condition，the product had the highest antioxidant power.And the antioxidant power rise with the increased concentration of adlay.Deeply，other ways to improve the antioxidant power were examined，which were：enzymolysis germinated adlay，enzymolysis adlay，germinated adlay，adlay.This study aims to provide a scientific basis to the development of adlay antioxidant peptide used as safe health product，at the same time，provide a basis for the mechanism for further analysis of antioxidant adlay peptide structure.

adlay；anti-oxidation；enzymolysis

TS201.1

A

1002-0306（2011）01-0100-04

2009-12-14

李存芝（1969-），女，博士，讲师，主要从事食品化学，食品加工方面的研究。

广东省高校科技成果产业化重大项目资助（cgzhzd0709）；广州日康大学生创新基金。