羊蹄蒽醌类成分的质控方法研究

吴泽青，帅欧，陈地灵，林励

（广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006）

质量

羊蹄蒽醌类成分的质控方法研究

吴泽青1，帅欧，陈地灵，林励*

（广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006）

目的：建立羊蹄药材中蒽醌类成分鉴别和含量测定方法，为羊蹄药材质量评价提供新依据。方法：采用薄层色谱法对羊蹄药材进行定性鉴别，超高速液相色谱法（UPLC）建立羊蹄药材中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等成分的含量测定方法。结果：羊蹄药材中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等成分的薄层鉴别特征明显，UPLC法能快速地同时测定羊蹄中大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量。结论：该方法具有良好的专属性和重现性，能准确、稳定、快速地对羊蹄药材进行鉴别和定量测定，可作为羊蹄药材中蒽醌类成分的质量控制方法。

羊蹄；蒽醌；薄层色谱法；超高速液相色谱法；含量测定

草药羊蹄为蓼科酸模属多年生草本植物羊蹄Rumex japonicusHoutt.的根，又名癣草、土大黄、金不换、牛舌条等，多分布于我国华东、华中、华南等地区，资源丰富。羊蹄味苦，性寒，有杀虫、活血止血、清热解毒等功效，用于治疗皮肤病、疥癣、各种出血及各种炎症[1]。羊蹄根中的主要化学成分为大黄素、大黄酚、大黄素甲醚，具有止血和抗衰老等药理活性[2-3]。目前尚未见有羊蹄药材薄层同时鉴别和同时快速测定其大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等蒽醌类成分含量的报道。为进一步提高羊蹄药材的质控水平，作者进行了本项研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

DFT-200型手提式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）、KQ-500型超声仪（40 KHz，500 w，昆山市超声仪器有限公司）、DHG-90553A型电热鼓风干燥箱（上海精密实验设备有限公司）、Sartorius B P211D分析天平（d＝0.01 mg）、2μL定量毛细管、Waters Acquity UPLCTM超高速液相色谱仪-二极管阵列检测器（PDA）、Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18柱 （2.1×50 mm，1.7μm）、Empower 2色谱工作站。

1.2 材料

羊蹄药材购于广东各大药店、中药饮片厂及药材市场，经广州中医药大学中药学院林励研究员鉴定为蓼科酸模属植物羊蹄Rumex japonicusHoutt.的根。大黄素、大黄酚、大黄素甲醚（四川省维克奇生物科技有限公司，批号：201007，201007，201003，纯度≥98%）。HPLC级乙腈（默克公司生产），冰醋酸（优级纯，天津科密欧化学试剂厂），甲醇、石油醚、环己烷、甲酸乙酯、甲酸等试剂均为分析纯，水为超纯水，硅胶G板（青岛海洋化工厂）。

2 薄层色谱

2.1 对照品溶液的制备

取大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，加甲醇制成每1 mL含大黄素、大黄酚、大黄素甲醚分别为1.35，1.27，1.42 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取羊蹄根药材粉末约0.5 g，精密称定，置于250 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100 mL，称定重量，超声提取45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得。

2.3 方法与结果

照《中国药典》（2010版一部附录VIB）试验薄层色谱法，吸取供试品溶液和对照品溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚-环己烷-甲酸乙酯-甲酸（1.5∶2.5∶1.5∶0.1）上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，结果见图1。

3 含量测定

3.1 溶液制备

3.1.1 对照品溶液的制备 精密称取经五氧化二磷干燥24 h的大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品适量，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液浓度分别为0.037 4，0.077 0，0.046 6 mg·mL－1；分别精密量取 0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液即得。

图1 羊蹄药材TLC图

3.1.2 供试品溶液的制备 按照2.2项下制备供试品溶液后，0.22μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

3.2 色谱条件

Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；乙腈（A）-0.2%冰乙酸水溶液（B）为流动相，梯度条件为0～7min，40%A～65%A，流速0.3 mL·min－1；检测波长：254 nm；进样量：1μL；柱温：室温。分别吸取对照品溶液、供试品溶液注入色谱仪，记录色谱图，结果大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰与样品中其他成分峰均能达到基线分离，见图2。

3.3 UPLC方法学考察

3.3.1 线性关系考察 分别精密吸取各浓度混合对照品溶液进样1μL，记录色谱图，测定峰面积，以对照品进样量（ng）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程及线性范围见表1。

3.3.2 精密度试验 在上述色谱条件下，精密吸取大黄素、大黄酚、大黄素甲醚浓度为0.014 96，0.030 80，0.018 64 mg·mL－1的混合对照品溶液连续测定6次，进样量为1μL，测定峰面积，结果大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积RSD分别为0.56%，0.74%，0.62%，表明精密度良好。

图2 对照品及羊蹄药材含量测定UPLC图

表1 线性关系考察结果

3.3.3 稳定性试验 在上述色谱条件下，取同一样品溶液（批号20110320），分别于0，2，4，8，12，24 h测定，测得羊蹄药材样品中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚平均含量分别为0.11%、0.17%、0.10%，RSD分别为0.69%、0.79%、1.19%。结果表明样品在24 h内稳定。

3.3.4 重复性试验 精密称取同一样品（批号20110320）6份，按3.1.2项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下，测得样品中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚平均含量分别为1.2，1.8，1.0 mg·g－1，RSD分别为0.75%、0.83%、0.64%，表明方法重现性良好。

3.3.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的供试样品0.25 g（批号20110320）共6份，分别加入混合对照品溶液，按3.1.2项下方法制备供试品，按3.2项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表2。

3.4 样品含量测定

分别取待测样品，按3.1.2项下方法制备供试品溶液，在3.2项色谱条件下，进行样品含量测定，结果见表3。

表2 大黄素、大黄酚、大黄素甲醚加样回收率试验

表3 不同来源羊蹄药材中蒽醌类成分含量/mg·g－1

4 讨论

4.1 提取条件的选择

供试品的制备方法考察了甲醇超声、三氯甲烷回流提取、甲醇超声后盐酸水解等方法，经试验供试品色谱中都能显示3种成分的特征斑点，但甲醇超声方法简单快速，因此选择甲醇超声直接制备含量测定供试品溶液。

4.2 展开剂的选择

经考察石油醚-丙酮-甲醇-甲酸、石油醚-丙酮-苯、石油醚-环己烷-甲酸乙酯-甲酸等体系展开剂效果，其中石油醚-环己烷-甲酸乙酯-甲酸（1.5∶2.5∶1.5∶0.1）上层液为展开剂时，斑点清晰，尤其对于大黄酚和大黄素甲醚的分离效果较好。

4.3 色谱条件的选择

相关文献报道羊蹄药材含量测定所用流动相为甲醇-水-高氯酸、甲醇-磷酸水等[4-6]，经过考察甲醇-水-高氯酸、甲醇-水、乙腈-冰乙酸及甲醇-磷酸水等体系流动相，发现前3种流动相均可达到较好的分离效果，甲醇-水作为流动相时拖尾现象比较明显，甲醇-磷酸水、乙腈-冰乙酸体系中磷酸、冰乙酸为中强酸和弱酸，相比于高氯酸酸性较低，对色谱柱损伤较小。

4.4 小结

羊蹄药材中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等成分的薄层鉴别特征明显。含量测定试验结果表明不同来源及产地羊蹄药材中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等成分差异较大。6批次的测试样品中大黄素的含量范围在0.77～1.42 mg·g－1，大黄酚的含量范围在1.23～1.83 mg·g－1，大黄素甲醚的含量范围在0.71～1.84mg·g－1。HPLC法测定羊蹄药材大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等成分含量所用时间较长，UPLC法相比于HPLC法分析效率高，分析速度快，并且减少有机溶剂的使用，达到更高的分析灵敏度。采用UPLC法测定羊蹄药材中大黄酚、大黄素、大黄素甲醚的含量，方法学考察结果表明，该法线性关系良好，回收率、精密度高，重复性良好，具有准确、灵敏、快速的特点，且分析效率高，可作为羊蹄药材质量控制与评价的方法之一。

[1]中国医学科学院药物研究所.中药志[M].第1册.北京：人民卫生出版社，1993：40-49.

[2]李淑娟，张力，张丹参，等.大黄酚抗衰老作用的实验研究[J].中国老年学杂志，2005，25（11）：1362-1364.

[3]孙晓如，周新新，朱荔，等.中药羊蹄根抑制激动剂诱导血管收缩活性成分的分离及药理活性研究[J].南京医科大学学报，1999，19（6）：488-491.

[4]邹剑成，邱小梅，王定勇.RP-HPLC法测定羊蹄根中大黄酚的含量[J].中药材，2009，32（7）：1081-1083.

[5]王雪芹，赵祖兴，陈吉炎，等.武当山5种土大黄中3种蒽醌类成分的含量比较[J].医药导报，2010，29（9）：1206-1208.

[6]原源，陈万生，张汉明，等.HPLC法测定酸模属植物根中蒽醌类成分的含量[J].第二军医大学学报，2000，21（10）：952-954.

Study on the Quality Control of Anthraquinones in Rumex japonicus Houtt.

WU Ze-qing，SHUAIOu，CHEN Di-ling，LIN Li

（School of Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Chinese Medcine，Guangzhou510006，China）

Objective：To establish the new methods that can identify and assay the anthraquinones ofRumex japonicusHoutt.while be used to evaluate the quality of theRumex japonicusHoutt..Methods：Thin layer chromatography（TLC）was used for the identification and UPLC was applied to assay the contents of emodin，chrysophanol and physcion ofRumex japonicusHoutt..Results：The characteristic of TLC was distinct.It showed that the UPLC can fast assay the contents of emodin，chrysophanol and physcion at one time.Conclusion：These methods can be used in qualitative identification and quantitative assay of the anthraquinones ofRumex japonicusHoutt.with good specificity，reproducibility and stability.

Rumex japonicusHoutt.；Anthraquinone；TLC；UPLC；Content determination

*林励，Tel：（020）39358270，E-mail：LL76611＠yahoo.com.cn

2011-10-17）