生甘遂与制甘遂中的二萜类成分甘遂大戟萜酯D的含量研究△

程显隆，肖新月*，邹秦文，刘薇，石岩，魏锋，马双成*，林瑞超

(1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.北京联馨药业有限公司，北京 102628)

质 量

国家科技支撑计划——常见与重要药品安全标准研究(2006BAI14B01)，国家科技重大专项——中药质量标准研究和信息化体系建设平台(2009ZX093008-004)

*肖新月, E-mail:xiaoxy@sina.com；*马双成，E-mail：mashuangcheng@yahoo.com

生甘遂与制甘遂中的二萜类成分甘遂大戟萜酯D的含量研究△

程显隆1，肖新月1*，邹秦文2，刘薇1，石岩1，魏锋1，马双成1*，林瑞超1

(1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.北京联馨药业有限公司，北京 102628)

目的建立甘遂中甘遂大戟萜酯D的含量测定方法，并比较生甘遂和醋甘遂中甘遂大戟萜酯D的含量差异。方法样品以甲醇为提取溶剂，超声处理后，以HPLC法分析。采用菲罗门 lunar C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱分离，柱温40 ℃，以乙腈-水(70∶30)为流动相，流速1.0 mL·min-1；检测波长235 nm。结果甘遂大戟萜酯D线性范围分别为0.216～8.64 μg(r=0.999 9)，平均加样回收率为103.5 %(n=9)；44批次甘遂中，甘遂大戟萜酯D的含量为0.008 %～0.036 %。结论该方法准确、可靠，具有良好的重复性和稳定性，可用于甘遂大戟萜酯D的定量分析。

甘遂；醋甘遂；甘遂大戟萜酯D；高效液相色谱法

甘遂始载于《神农本草经》，列为下品。《中国药典》2010年版收载的甘遂为大戟科(Euphobiaceae)大戟属(Euphorbia)植物甘遂EuphorbiakansuiT.N.Liou ex T.P.Wang的干燥块根；具有泻水逐饮，消肿散结的功能，用于水肿胀满，胸腹积水，痰饮积聚，气逆咳喘，二便不利，风痰癫痫，痈肿疮毒[1]。现代研究表明，甘遂化学成分还具有抗肿瘤、抗生育、抗病毒、调节免疫系统等活性[2]。但其毒性较强，临床使用剂量十分有限，过量则引起腹痛、腹泻，严重时会出现剧烈呕吐、血压下降、脱水和呼吸衰竭等症状。甘遂的化学成分研究表明,其主要有效成分为二萜酯类成分,且活性多样,尤其是巨大戟萜醇(ingenol)型二萜酯类有显著的抗癌、抗病毒活性等[3-5]。因此以二萜类成分为指标来控制甘遂的质量是十分有意义的。

1 仪器、样品与试药

1.1仪器

岛津2010型高效液相色谱仪。

1.2样品与试药

对照品甘遂大戟萜酯D(KansuiphorinD)为实验室自制，经1H-NMR和13C-NMR波谱法鉴别其结构，HPLC归一化法测定其纯度为98.1%。乙腈为色谱纯，甲醇、醋酸乙酯等均为分析纯，纯净水为Milli-Q纯水。共收集了44批生、制甘遂样品，样品收集信息见表1。

2 方法与结果

2.1色谱条件

采用菲罗门lunarC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)，柱温40℃；流动相为乙腈-水(70∶30)，流速1.0mL·min-1；检测波长235nm；进样量10μL。KansuiphorinD的分离度为2.8，理论塔板数为9000。

2.2对照品溶液的制备

精密称取对照品KansuiphorinD5mg，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得每1mL含KansuiphorinD0.2mg的混合溶液。色谱图见图1A。

2.3供试品溶液的制备

取本品粉末(过四号筛)2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。色谱图见图1B。

表1 样品来源

图1 甘遂大戟萜酯D对照品(A)和生甘遂样品1(B)HPLC图

2.4线性关系的考察

按上述色谱条件，分别精密吸取上述对照品溶液1，5，10，20，30，40μL，注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积值Y为纵坐标，进样量X为横坐标，绘制标准曲线，计算Kansuiphorin D。得回归方程为Y=15926894.8030X+1121.3609，r=0.9999，结果表明，Kansuiphorin D进样量在0.216～8.64μg与峰面积呈良好的线性关系。

2.5精密度试验

取同一对照品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，测定峰面积，结果KansuiphorinD色谱峰面积的RSD=0.62%。

2.6稳定性试验

取1号样品的供试品溶液，按上述色谱条件分别于0，2，4，6，8，16h进样测定，结果KansuiphorinD色谱峰面积的RSD=0.52%。

2.7重复性试验

取1号样品6份，精密称定，按2.3项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定含量，结果KansuiphorinD的含量平均值为0.020 %，RSD=1.05 %。

2.8加样回收率试验

取已知含量的1号样品按1g的50%，100%，150%3个质量等级称样9份，每个质量等级各3份。分别加浓度为0.2mg·mL-1的3组对照品甲醇溶液25mL，按供试品溶液制备方法处理得供试液，按上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表2。

表2 Kansuiphorin D加样回收率试验

注：Kansuiphorin D对照品加入量均为0.201 mg

2.9样品测定

取44批甘遂样品，按2.3项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定(每个样品取样2份，每份进样2次，总计n=4)。以外标法计算，按干燥品计，Kansuiphorin D的含量结果见表3。

表3 44批甘遂样品中Kansuiphorin D含量测定 /%

注：n=4

3 讨论

3.1流动相的选择

分别采用甲醇-水(70∶30)、甲醇-0.03%甲酸溶液(70∶30)、乙腈-水(70∶30)为流动相进行试验。结果在甲醇-水(70∶30)、甲醇-0.03%甲酸溶液(70∶30)流动相系统中，待测成分与其他化学成分的色谱峰基线处难以完全分离；最终选用乙腈-水(70∶30)为流动相，获得满意的分离效果。

3.2检测波长的选择

KansuiphorinD结构的紫外光谱最大吸收在235nm，故选择235nm作为紫外检测波长。其紫外光谱图见图2。

图2 对照品DAD光谱图

3.3柱温的考察

考察了柱温为25，30，40℃时被检测成分的分离效果，结果二萜均可达到很好的分离效果，R≥1.5。本实验采用40℃柱温。

3.4提取溶剂和提取方法的比较

分别以甲醇、醋酸乙酯为提取溶剂制得不同样品，结果表明，甲醇提取效率稍高，并且杂质干扰少，故采用甲醇作为溶剂来处理样品。同时考察甲醇超声提取和加热回流提取，结果发现两种提取方法样品含量无显著变化，故采用甲醇超声提取的方法。

3.5提取时间的选择

考察了20，30，40min的提取效果，测定含量。最后确定以40min进行超声处理(功率250W，频率50kHz)。

3.6提取溶剂量的考察

本实验考察了2g样品分别加醋酸乙酯25，50，100mL进行提取，结果发现3种溶剂量对提取效率无显著差异，考察到为了提高检测信号，降低基线对测定的影响，采用2g样品加甲醇25mL的方法进行提取。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：81-82.

[2] 郭晓庄.有毒中草药大辞典[M].天津：天津科技翻译出版公司,1992：739.

[3] 史海明，闵知大，屠鹏飞，等.中国大戟属植物中二萜成分的化学及生物活性[J].化学进展，2008，20(2-3)：375-385.

[4] 宿树兰，段金廒，丁安伟.大戟二萜醇酯类成分及其毒效关系研究进展[J].世界科学技术——中医药现代化，2007，9(4)：67-73.

[5] 修彦凤,曹艳华,张永太.甘遂的药理作用研究进展[J].上海中医杂志,2008，42(4)：79-81.

DeterminationofKansuiphorinDinKansuiRadixanditsProcessedProducts

CHENG Xian-long1, XIAO Xin-yue1, ZOU Qin-wen2, LIU Wei1, SHI Yan1, WEI Feng1, MA Shuang-cheng1, LIN Rui-chao1

(1.NationalInstitutefortheControlofPhamaceuticalandBiologicalProducts,Beijing100050,China;2.BeijinLianxinPharmaceuticCo.,Ltd,Beijing102628,China)

Objective: To develop an HPLC method for determination of Kansuiphorin D in Kansui Radix and to compare the differences of the contents of euphol and tirucallol in Kansui Radix and its processed product (processed with vinegar) by HPLC.MethodsThe sample was extracted by methanol. HPLC analysis was performed on an lunar C18column, column temperature was40℃.The mobile phase was the system of acetonitrile-water(70∶30). The flow rate was1.0mL·min-1and UV detection was set at235nm.ResultsDetermined the contents of Kansuiphorin D of44samples by HPLC.ConclusionThe methad was simple, rapid and accurate with good productivity, which can be used to determine of Kansuiphorin D in Kansui Radix and its processed product.

Kansui Radix; Processed product (processed with vinegar); Kansuiphorin D; HPLC

2011-04-02)