11种铁线莲属药用植物地上部分总黄酮含量比较研究△

冯玲枫，翁美娅，田富饶，陈建华

(1.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华 321004;2.浙江大学生物医学工程与仪器科学学院,浙江 杭州 310027)

浙江省重大科技攻关项目(2006C13012)

*冯玲枫，E-mailfeng0032@126.com；*陈建华，E-mailsky78@zjnu.cn

11种铁线莲属药用植物地上部分总黄酮含量比较研究△

冯玲枫1*，翁美娅1，田富饶2，陈建华1*

(1.浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华321004;2.浙江大学生物医学工程与仪器科学学院,浙江 杭州310027)

目的对产自浙江省的11种铁线莲属药用植物的茎、叶中总黄酮含量进行测定分析,试图发现铁线莲属植物地上部分总黄酮含量较高的具体种类及铁线莲属植株中总黄酮含量较高的部位。方法以芦丁为标品，采用紫外分光光度法。结果(1)芦丁对照品在15.936～47.808μg·mL-1(r=0.9999)线形关系良好，平均回收率为100.8%，RSD=1.74%。(2)总黄酮含量总体趋势为叶>茎，铁线莲属植物叶中总黄酮平均含量为2.636%，茎中总黄酮平均含量为0.617%。(3)总黄酮含量最高的为女萎叶，达5.581%，最低为湖州铁线莲茎，仅0.195%。(4)铁线莲属植物不同物种的总黄酮含量差异显著，同一物种不同部位间的总黄酮含量也存在一定的差异。(5)聚类分析表明，铁线莲属地上部分总黄酮含量和该属植物系统演化有一定的相关性。结论研究表明女萎、山木通地上部分较适合用作黄酮类药物开发，该研究同时将为铁线莲属不同药用种类、不同药用部位及药用植物亲缘关系的深入研究提供参考依据。

铁线莲属；药用植物；地上部分；总黄酮；系统演化

毛茛科铁线莲属(ClematisL.)植物资源丰富，全世界约有355种,主要分布于热带和亚热带，中国大约有150种[1-2]，其中约85种可作药用[3]。铁线莲属植物具有镇痛、抗菌、消炎和抗癌等多种药理活性。铁线莲属植物的药理作用与其化学成分相关，铁线莲属植物化学成分复杂，主要为皂苷类、黄酮类、木脂素。此外还包括挥发油、特有成分及花色苷、香豆素、生物碱、有机酸类、烷烃等其他化合物[4]。我国铁线莲属植物资源丰富，因此有必要进一步拓展其研究范围，为其药用植物资源的开发利用提供新的理论依据。

黄酮类化合物广泛存在于自然界中，是植物在长期自然选择过程中产生的一些次级代谢产物，有10多个类别，现已发现4000余种黄酮类化合物[5]，广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实中[6]。黄酮类化合物具有抗氧化、消除自由基[7-8]、调节心血管系统[9-10]、抗癌防癌[11-12]、抗炎免疫及抗衰老[13]等功效，还具有吸收紫外辐射、止咳、祛痰、泻下、解痉、提高记忆力、抗过敏、活血化瘀、利胆及肝脏保护作用等[14]。

董彩霞等[15]从棉团铁线莲(Clematishexapetala)干燥根及根茎中分离鉴定了12个黄酮类化合物。孙凤等[16]从圆锥铁线莲(C.terniflora)全草中分离得到多种黄酮类化合物。古丽巴哈尔·阿巴拜克力[17]对西伯利亚铁线莲(C.sibirica)地上部分有效成分分析及总黄酮的测定证明不同部位均含有黄酮类化合物，且其含量均比较高。古丽巴哈尔·阿巴拜克力等对新疆粉绿铁线莲(C.glauca)不同部位总黄酮含量比较研究也证明了不同部位的黄酮的存在[18]。

《中国药典》[19]收载源自铁线莲属植物的中药主要有川木通和威灵仙，传统药用部位为根、根茎或茎，考虑到铁线莲属不同药用部位的开发利用和铁线莲属植物资源利用率的进一步提高，本研究对浙江产11种铁线莲属药用植物地上部分(茎和叶)总黄酮含量分别进行了测定，为铁线莲属不同药用种类、不同药用部位及药用植物亲缘关系的深入研究提供参考依据。

1 仪器与材料

YP3001N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；Spectrum752PC全波长扫描-紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；芦丁对照品(中国药品生物制品检定所，批号：10080-200707，纯度92.5%，供紫外法测定)；其余试剂为分析纯。

圆锥铁线莲(C.terniflora)、毛蕊铁线莲(C.lasiandra)、单叶铁线莲(C.henryi)、威灵仙(C.chinensis)、毛果扬子铁线莲(C.puberulavar.tenuisepala)、钝齿铁线莲(C.apiifoliavar.argentilucida)、柱果铁线莲(C.uncinata)、女萎(C.apiifolia)、山木通(C.finetiana)、毛果铁线莲(C.peteraevar.trichocarpa)采集地均为金华北山，湖州铁线莲(C.huchouensis)采集地为湖州市郊。以上实物材料均经浙江师范大学陈建华教授鉴定，部分样品得到中国科学院植物研究所李良千研究员核定，凭证标本存放于浙江师范大学植物标本室中。

2 方法与结果

2.1对照品储备液的制备

精密称取对照品芦丁9.96mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，冰箱内保存，备用。

2.2样品溶液的制备

将新鲜材料洗净、烘干，药材粉碎成粉末，精密称取2.000g，置索氏提取器中，加适量乙醚提取至无色，弃去醚液，药渣挥去乙醚，加适量甲醇继续提取至无色，将提取液转移至25mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得[20-21]。

2.3两种显色剂考察[22-23]

2.3.1 10 %三氯化铝方法显色 选取圆锥铁线莲叶和单叶铁线莲为代表，吸取1.0 mL样品溶液，加1.0 mL 10 %三氯化铝，用甲醇定容至25 mL，摇匀，静置15 min后，以相应试剂为空白，测吸光度A，测得全波长扫描图；吸取芦丁对照品储备液4.0 mL，采用10 %三氯化铝方法显色，测得全波长扫描图谱，见图1。结果显示3个图谱中最大吸收波长的重叠性不好，说明这种显色方法不合适。

2.3.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH方法显色 选取圆锥铁线莲叶和单叶铁线莲为代表，吸取1.0 mL样品溶液，加水至6.0 mL，加1.0 mL 5 %NaNO2溶液，摇匀，静置6 min后，加1.0 mL 10 %Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6 min后，再加10.0 mL 4 % NaOH溶液，用水定容至25.0 mL，摇匀，15 min后，以相应试剂为空白测吸光度A，测得全波长扫描图谱；吸取对照品芦丁对照品储备液4.0 mL，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH方法显色，测得全波长扫描图，见图2。结果显示NaNO2-Al(NO3)3-NaOH方法显色后对照品和样品的最大吸收重叠性比较好。

图1 圆锥铁线莲叶、单叶铁线莲叶和芦丁对照品用10 %三氯化铝方法显色后全波长扫描比较图谱

图2 圆锥铁线莲叶、单叶铁线莲叶和芦丁对照品用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH方法显色后全波长扫描比较图谱

2.4测试波长的选择

由图2可知，对照品溶液和样品溶液显色后的最大吸收波长分别是508,502,500nm,因对照品溶液所受干扰较样品少，故选择对照品溶液最大吸收波长508nm为测定波长。

2.5标准曲线绘制

精密吸取对照品储备液2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL置25mL容量瓶中，加水至6.0mL，先加1.0mL5%NaNO2摇匀，静置6min后，再加1.0mL10%Al(NO3)3摇匀，静置6min后，再加10.0mL4%NaOH溶液，用水定容至25mL，摇匀，15min后于508nm处测定吸光度，以吸光度值A为纵坐标，浓度C(μg·mL-1)为横坐标进行线性回归，得方程A=0.0115C+0.0034，r=0.9999，表明浓度在15.936～47.808μg·mL-1线性关系良好。

2.6精密度试验

精密量取4.0mL的对照品溶液6份，按2.5法测定吸光光度值，结果RSD=0.58 %。

2.7稳定性试验

精密称取干燥圆锥铁线莲叶2.000g，按照2.2方法制备供试液和2.5方法测定，首次测定后，每隔10min测定1次，记录吸光度值，考察其显色后的稳定性。样品在1.0h内稳定，RSD=0.83 %。

2.8重复性试验

精密称取6份干燥圆锥铁线莲叶样品，分别按照2.2方法制备供试液和2.5方法测定，以不加供试液的相应溶液作为空白，在波长508nm处测定吸光度值，RSD=0.55 %，说明重复性良好。

2.9回收率试验

精密称取已知含量的圆锥铁线莲叶适量，分别加入高、中、低3种浓度的对照品，按供试品溶液制备方法制备。按2.5方法操作，测定总黄酮含量，计算回收率，结果见表1。

表1 芦丁加样回收率试验

2.10 铁线莲属植物不同物种、不同部位总黄酮含量的测定

参照2.2制备铁线莲属植物不同物种、不同部位供试液22份，在508 nm处测定吸光光度值，重复测定3次，计算总黄酮含量及RSD。结果见表2、3。

表2 铁线莲属不同物种、不同部位的总黄酮含量 /%

注：英文字母表示不同物种同一部位的差异显著性水平(P<0.05)

表3 铁线莲属不同物种、不同部位总黄酮含量双因素方差分析

注：**表示在α=0.01水平上极显著差异，A表示不同种类，B表示不同器官

从表2和表3可以看出，11种铁线莲属药用植物不同部位总黄酮含量趋势为叶>茎，铁线莲属植物叶总黄酮平均含量为2.636 %，茎中总黄酮平均含量为0.617 %。总黄酮含量最高的为女萎叶达5.581 %，最低为湖州铁线莲茎仅0.195 %。不同物种、同一物种不同部位间总黄酮含量都有相当的差异。从表2可以看出，茎中总黄酮含量，除了圆锥铁线莲和钝齿铁线莲差异不显著，其他种间均差异显著，变幅为0.195 %～2.027 %,含量最高的为柱果铁线莲茎，最低的是湖州铁线莲茎；不同种间叶中总黄酮含量差异显著，变幅为0.387 %～5.58 1%，最高的为女萎叶，最低的为湖州铁线莲叶。地上部分总黄酮含量最高的为女萎，达6.090 %，其次为山木通，达5.591 %，最低的为湖州铁线莲，仅0.582 %。总体而言，叶中总黄酮含量高的种，茎的总黄酮含量也相对较高。

根据茎、叶中总黄酮含量进行聚类分析，分析11种铁线莲属植物在聚类图上的位置关系与系统演化上的相关性，见图3。

图3 11种铁线莲属植物地上部分总黄酮含量的聚类分析图

从图3可知，在L=0.64处可以明显区分出3个区域，毛蕊铁线莲、圆锥铁线莲和单叶铁线莲的亲缘关系较近，女萎、山木通、柱果铁线莲、钝齿铁线莲、毛果铁线莲、威灵仙、毛果扬子铁线莲的亲缘关系相对较近，湖州铁线莲与其他10种铁线莲的亲缘关系最远。

3 结论与讨论

通过甲醇提取、硝酸铝显色、紫外分光光度法测定，分析了铁线莲属药用植物茎和叶中总黄酮的含量，该方法准确、快速，操作简单，重复性好，适于铁线莲属植物不同种类和不同部位的总黄酮含量测定。

西伯利亚铁线莲地上部分的研究表明不同部位黄酮含量相差较大，结果为叶>果实>茎的含量[17]。新疆粉绿铁线莲不同部位总黄酮含量比较的研究也表明不同部位的黄酮含量存在差异，结果为叶>花>果实>茎[18]。本研究以11种浙江产铁线莲属药用植物茎和叶为材料，研究发现不同铁线莲属植物、同种不同部位总黄酮含量总体存在显著差异，叶的总黄酮含量总体大于茎，这和前人的研究结论大致相似，不同种类和同一种类不同药用部位间的成分差异应主要是遗传差异引起的。

根据11种铁线莲属植物茎、叶及地上部分总黄酮含量的聚类分析图，可把11种铁线莲属植物分为3类：毛蕊铁线莲、圆锥铁线莲和单叶铁线莲聚为一类(Ⅰ区)，女萎、山木通、柱果铁线莲、钝齿铁线莲、毛果铁线莲、威灵仙、毛果扬子铁线莲聚为一类(Ⅱ区)，湖州铁线莲聚为一类(Ⅲ区)。其中Ⅰ区主要属尾叶铁线莲组，Ⅱ区为威灵仙组，Ⅲ区为铁线莲组，与《中国植物志》和王文采院士的观点基本一致[1-2]，表明铁线莲属地上部分总黄酮含量和该属植物系统演化有一定的相关性；另外根据系统分类学观点，圆锥铁线莲应归为威灵仙组，但聚类图显示圆锥铁线莲与毛蕊铁线莲、单叶铁线莲亲缘关系较近，这值得更深入地研究。

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ComparasiononTotalFlavonoidContentfromAerialPartsof11MedicinalPlantsofClematisL.

FENG Ling-feng1,WENG Mei-ya1,TIAN Fu-rao2,CHEN Jian-hua1

(1.CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China; 2.CollegeofBiomedicalEngineering&InstrumentScience,ZhejiangUniversity,Hangzhou310027,China)

Objective: To find out the species and organs with higher content of total flavonoids in the aerial parts of 11Clematisspecies collected from Zhejiang province.MethodsThe ultraviolet spectrophotometric method was uesd with rutin as standard.Results(1)There was good linearity(r=0.999 9)during the range of 15.936～47.808 μg·mL-1for rutin.The average recovery was 100.8 % and the RSD=1.74 %.(2)The total flavonoids from different parts ofClematisplants were different.The leaves contained more flavone than the stems,respectively the average content of total flavonoids in leaves and stems was 2.636 %,0.617 %.(3)Clematis.apiifolialeaves had the highest total flavonoids,5.581 %,significantly higher than others whileC.huchouensisonly 0.195 %.(4)Analysis showed that the amount of flavone in various plants and organs was significantly different.(5)Cluster analysis showed that there was a certain correlation between content of total flavonoids in the aerial parts of 11Clematisspecies and evolution of this genus.ConclusionThis study suggested that the aerial parts ofC.apiifoliaandC.finetianacould be used as drug development of total flavonoids.And this study provided reference for further research of different species, different parts and phylogenetic correlation from medicalClematisresources.

ClematisL.; Medicinal plants; Aerial parts; Total flavonoids; Phylogenetic correlation

2011-02-18)