结球生菜多酚氧化酶动力学特性研究

饶先军，刘 升，王则金，冯双庆，颜丽萍

(1.福建农林大学食品科学学院，福建福州350002; 2.北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京100097; 3.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083)

结球生菜多酚氧化酶动力学特性研究

饶先军1，刘 升2，*，王则金1，冯双庆3，颜丽萍1

(1.福建农林大学食品科学学院，福建福州350002; 2.北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京100097; 3.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083)

为解决生菜加工贮藏过程中出现的褐变问题，研究了结球生菜多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)动力学特性，分析了pH、温度及底物浓度等因素对PPO活性的影响，建立了结球生菜褐变的反应动力学方程。结果表明，结球生菜最适pH为8.0，最适温度为40℃。用Michaelis-Menten机理描述可得结球生菜PPO相应的动力学参数Km= 0.0691mol/L，vmax=26.5957U/min。生菜叶片组织中的PPO活性较强，叶柄和茎部组织中的PPO活性差异不大，均低于叶片组织中的PPO活性，且结球生菜茎部切口处已经发生褐变的部分PPO活性为6.12U/min，远高于没有发生褐变的部分。

结球生菜，多酚氧化酶，褐变，动力学

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜结球生菜 2009年10月17日采收于北京市顺义区，品种为射手101。

Thermo Fisher高速冷冻离心机，岛津UV-1800紫外可见分光光度计，HANNA HI8418 pH计，Metteler PE360电子天平，北京长风HW.SY11-K数显恒温水浴锅，Eppendorf移液器及一些常规的实验设备。

1.2 实验方法

1.2.1 PPO粗酶液制备 取新鲜结球生菜切碎混匀，准确称取2.0g置于研钵中，加入少量石英砂和4.0mL预冷过的50.0mmol/L pH7.0的磷酸缓冲液(PBS)，冰浴研磨匀浆后转移到50mL离心管中，用6mL上述的PBS冲洗研钵3次，离心(4℃，12000r/min，15min)，取上清液保存备用。

1.2.2 PPO活性测定 将 50.0mmol/L pH7.0PBS、0.1mol/L的邻苯二酚溶液，于25℃下保温10min后，取2.8mL上述保温过的PBS和0.1mL邻苯二酚溶液置于石英比色皿中，再迅速加入0.1mLPPO粗酶液，混匀后于398nm波长处测定反应体系吸光度A值，每5s记录一次，共3min，测定重复3次。以每克样品(鲜重)吸光度变化值增加1为1个活性单位U，酶活性可以表示为U/min。

1.2.3 pH实验 分别取2.8mL不同pH的缓冲液(pH=4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，加入0.1mL 0.1mol/L的邻苯二酚溶液后，再迅速加入0.1mL粗酶液，混匀后在398nm波长条件下测定其吸光度变化值。

1.2.4 温度实验 取50mmol/L、1.2.3中测得最适pH的磷酸缓冲液，浓度为0.1mol/L邻苯二酚溶液分别在0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100℃的环境中恒温10min，取出后迅速加入0.1mL粗酶液，混匀后在398nm波长条件下测定其吸光度变化值。

1.2.5 底物浓度实验 在2.4mL浓度为0.1 mol/L磷酸缓冲液(1.2.3中测得最适pH)中，分别加入浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mol/L的邻苯二酚溶液0.4mL，然后再分别加入0.2mL PPO粗酶液，迅速摇匀，在398nm波长条件下测定其吸光度变化值，测得粗酶液的活性。

1.2.6 组织定位实验 结球生菜分为叶、叶柄、茎三部分，按1.2.1方法制备粗酶液，其中磷酸缓冲液为pH8.0，并按1.2.2方法测定PPO活性。

2 结果与分析

2.1 pH对PPO活性的影响

在pH4.0～10.0范围内进行酶活性测定，pH对PPO活性的影响如图1所示。PPO的最适pH因酶和底物的不同而不同，当以C6H6O2为底物时，从图1中可以看出，PPO活性的适宜pH偏碱性，最适pH为8.0左右。当低于或高于该值时，PPO活性呈明显的下降趋势，当pH升至10.0时，其活性只有最高活性的54.63%;当pH降至4.0附近时，其活性仅为最高活性的1.87%，pH越低，酶活性下降越快。PPO是一种含Cu蛋白质［3］，其作用机制是铜的氧化还原作用，在酸性环境条件下，PPO中的Cu被解离出来，使其活性降低，因而可以防止褐变的产生;在pH大于8的碱性环境条件下，Cu会解离成不溶性的Cu(OH)2，使其失活，减少褐变产生。因此在生菜加工贮藏过程中可以根据这一性质考虑采取一些相关措施，如使用食用酸(柠檬酸等)来降低pH，且对酚酶辅基铜离子有螯合作用，抑制酶的活性，也能明显减少褐变发生［4］。

图1 pH对PPO活性的影响

2.2 温度对PPO活性的影响

将50mmol/L磷酸缓冲液、浓度为0.1mol/L邻苯二酚溶液分别在0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100℃的环境中恒温加热10min，取出后迅速加入0.1mL粗酶液，混匀后测定其酶的活性。PPO是一种蛋白质，不适宜的温度会破坏其活性部位三维结构的完整性，而这种结构又是保持酶活性的关键因素［5］。温度对PPO活性有双重影响，一是温度升高加快酶催化反应速度，二是促使酶蛋白变性，这是两种对抗反应的综合反应。从图2中可以看出，低温能抑制PPO活性，当温度在0～40℃条件下，PPO活性随着温度的上升而上升，至40℃时达到最高值;温度高于40℃时，PPO活性开始下降，60℃时PPO活性只有最大活性的55.3%;当温度升至80℃及以上时，PPO活性基本消失，仅为40℃条件下酶活性的15.53%。

图2 温度对PPO活性的影响

2.3 底物浓度对PPO活性的影响

以0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mol/L的邻苯二酚溶液为底物，研究了25℃、pH8.0条件下不同底物浓度的产物吸光度值随时间的变化规律，拟合所得的直线斜率即为反应的初速率v。由于该实验是在敞开的容器中进行，O2浓度较大且恒定，故可看成是单底物酶促反应，其机理为:

反应速率方程为

从图3中可以看出，C6H6O2浓度［S］对反应初速率影响很大，且在浓度较小时，其变化对反应速率的影响呈直线上升趋势，在浓度较大时，其变化对反应初速率影响较小，当达到一定值时趋于稳定，即vmax，此时再增加底物浓度也不能使反应速率加快，浓度太高反而使反应速率下降，这可能是PPO有效活性被结合后产生的抑制效果，符合上述Michaelis-Menten机理［6-7］。

图3 底物浓度对PPO活性的影响

2.4 米氏常数Km及vmax

由此说明，生菜褐变反应动力学符合米氏方程。

根据直线斜率与截距，求得反映底物与酶结合的亲和力米氏常数Km=0.0691mol/L，最大反应速率vmax=26.5957U/min。

图4 结球生菜米氏方程

2.5 生菜不同部位PPO活性

以结球生菜叶、叶柄、茎的提取酶液分别与邻苯二酚反应，测得的PPO活性，结果见图5。

图5 结球生菜不同部位PPO活性

从图5可知，结球生菜的叶片组织中PPO活性较高，为11.22U/min，叶柄和茎部组织中的PPO活性分别为叶片的30.75%和22.55%，差异不大，且均低于叶片，但生菜采收后茎部受机械切割，在贮藏和运输中其切口处很容易发生褐变。

2.6 生菜茎部切口处PPO活性

生菜在采收后，由于茎部切口处受到了机械损伤，在运输、贮藏和销售过程中切口处多酚类物质极易受多酚氧化酶氧化作用发生褐变而产生褐色物质，影响生菜的外观品质和商品价值。

由表1可以看出，结球生菜茎部切口处已经发生褐变的部分PPO活性为6.12U/min，远高于未发生褐变处的PPO活性，差异显著。

表1 生菜茎部切口处PPO活性

3 结论

3.1 结球生菜PPO活性适宜pH偏碱性，当pH8.0时，其PPO活性最大，为11.22U/min，因此在加工贮藏过程中应控制pH，使其pH呈酸性，以减少其褐变的发生;PPO活性在40℃时最大，为12.94U/min，低温有利于抑制酶的活性。

3.2 结球生菜褐变反应的动力学符合米氏方程所描述的单底物酶促反应动力学，其反应速率与底物的关系:

米氏常数Km=0.0691mol/L;最大反应速度vmax=26.5957U/min。

在实际生产中可以采取一些措施避开多酚氧化酶的最适反应条件，如采摘、运输、加工贮藏过程中把生菜尽量控制在低温的环境下，或适当调节(降低)pH。

3.3 结球生菜中的叶片PPO活性最强，叶柄和茎的PPO活性差异不大，但生菜采收后茎部受机械切割，在贮藏和运输中其切口处很容易发生褐变;结球生菜茎部切口处已经发生褐变的部分 PPO活性为6.12U/min，远高于没有发生褐变的部分。

［1］农业部全国农业技术推广总站.生菜花椰菜绿菜花生产160问［M］.北京:中国农业出版社，1998.

［2］廖锡祥.生菜、生菜包、生菜会［J］.烹调知识，2004 (2):21.

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［4］郑宝东，黄杰，郑金贵，等.建莲中多酚氧化酶动力学特性的研究［J］.中国食品学报，2003，3(3):41-45.

［5］金玉来，钱建亚.甘薯中多酚氧化酶的研究［J］.食品科学，1991(9):4-9.

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［7］Soledad chazarra，et al.Characterization of monophenolase activity of polyphenol oxidase from iceberg lettuce［J］.J Agric Food Chem，1999，47:1422-1426.

Study on the kinetic character of polyphenol oxidase in iceberg lettuce

RAO Xian-jun1，LIU Sheng2，*，WANG Ze-jin1，FENG Shuang-qing3，YAN Li-ping1
(1.College of Food Science，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China;2.Beijing Vegetable Research Center Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Beijing 100097，China; 3.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agriculture University，Beijing 100083，China)

For solving the problem of browning in the process and storage of iceberg lettuce，the Kinetic Character of polyphenol oxidase(PPO)in iceberg lettuce were studied.Analysised the PPO activity in different pH，temperature and substrate concentration，established the kinetic equation of iceberg lettuce browning.The results showed that the optimum pH and temperature of lettuce PPO was 8.0 and 40℃，respectively.The reaction kinetic of enzymatic browning was accordant with michaelis equation，the Kmand vmaxwere 0.0691mol/L and 26.5957U/min，respectively.The PPO activity in iceberg lettuce leaf tissue was very strong，little difference of PPO activity in the organization of petiole and stems，but lower than in the leaf tissue.And the PPO activity was 6.12U/min in iceberg lettuce stems incision which had some browning，much higher than no browning part.

iceberg lettuce;polyphenol oxidase;browning;kinetic

TS255.1

A

1002-0306(2011)09-0080-03

生菜(Lactuca sativa L.)，又名叶用莴苣，包括皱叶生菜、直立生菜、结球生菜，为菊科莴苣属一年或两年生草本植物，含有丰富的营养物质［1］。生菜属低糖、低脂肪蔬菜，富含水分，每100g食用部分含水分高达94%～96%，故生食清脆爽口，特别鲜嫩，每100g食用部分还含蛋白质1～1.4g、碳水化合物1.8～3.2g、维生素C10～15mg及一些矿物质，生菜还含有苹果酸和琥珀酸等有机物质以及莴苣素、天冬碱、精油、甘露醇和酶、甲状腺活动激素等活性物质［2］。生菜含有的莴苣素等苦味物质有镇痛催眠作用，并对消化无力、酸度低、便秘、高血压和心脏病均有治疗作用。在日常生活中生菜常在切割后被单独或同其它蔬菜包装在一起，是一种即食或配合沙拉食用的绿叶蔬菜。但生菜在加工和贮藏过程由于其含有的多酚氧化酶(PPO)氧化酚类物质会形成醌类化合物，进一步聚合形成褐色或棕色的聚合物，从而导致生菜切口处变褐变红，影响生菜的外观品质、营养价值和商品价值。因此，研究生菜PPO动力学特性，进一步采取有效的措施，最大程度地减少其在加工贮藏过程中的褐变，为生菜商业化加工和贮藏保鲜提供理论依据和技术支持，从而提高农民和企业的经济效益，带动整个生菜产业的长远发展。

2010-08-20 *通讯联系人

饶先军(1984-)，男，硕士研究生，主要从事食品加工及贮藏的研究。

国家863计划课题(2008AA100803);国家“十一五”科技支撑项目(2009BADB9B09-6)。