TGF-β1对乳腺癌细胞系Snail表达的影响

尹崇高 李洪利李文通孙永红张宝刚＊

(山东省潍坊医学院护理学院,1科研处医学研究实验中心,2病理学教研室,3附属医院病理科,潍坊 261053)

TGF-β1对乳腺癌细胞系Snail表达的影响

尹崇高 李洪利1李文通2孙永红3张宝刚2＊

(山东省潍坊医学院护理学院,1科研处医学研究实验中心,2病理学教研室,3附属医院病理科,潍坊 261053)

目的 通过 TGF-β1诱导乳腺癌 MCF-7发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)后检测锌指转录因子Snail表达的改变,探讨Snail在EMT及乳腺癌发生发展中的作用。方法 常规培养乳腺癌细胞株MCF-7后,用 TGF-β1诱导其发生 EMT,用 Transwell侵袭小室法进行细胞体外侵袭能力检测;用免疫组织化学方法及免疫荧光检测 E-cadherin、Vimentin、Snail的表达;用 real time PCR检测 E-cadherin、Vimentin 、Snail mRNA 的表达。结果 TGF-β1处理72h后的MCF-7细胞穿透能力明显增强。E-cadherin蛋白及mRNA表达减少,Vimentin、Snail蛋白及mRNA表达增加。结论E-cadherin、Vimentin是细胞发生 EMT的重要生物学标志,Snail可能在转录水平上调控 E-cadherin、Vimentin蛋白的表达,Snail在EMT和乳腺癌的发生发展中起着重要的作用。

TGF-β1; 乳腺肿瘤; 上皮-间质转化; Snail

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)发生于多种生理、病理过程,如胚胎发育、肿瘤转移等,其共同的细胞学机制为细胞间粘附的丧失与细胞迁移力的获得[1]。Snail是一种在EMT过程中居于重要地位的转录因子。EMT在多种肿瘤细胞获得侵袭转移能力中有重要作用[2]。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)是细胞外环境中重要的细胞因子,研究表明 TGF-β1能刺激正常犬肾上皮细胞(MDCK)向间质细胞表型转化[3]。本实验通过体外研究 TGF-β1对MCF-7迁移能力及Snail表达的影响,深入探讨提高MCF-7迁移力及可能的分子机制。

材料和方法

1. 材料

MCF-7细胞系由本实验中心保存提供,TGF-β1购自R&D公司;AMV第一链cDNA合成试剂盒购自上海生工生物技术有限公司;iQ SYBR Green Supermix购自北京元业伯乐有限公司;RPMI1640培养基为 Hyclone公司产品;E-cadherin、Vimentin、Snail一抗购自 Santa Cruz公司;引物由上海生工生物技术有限公司合成;标记有Cy3的羊抗兔二抗购自北京中杉生物技术有限公司。

2. 方法

2.1 细胞培养与处理

乳腺癌细胞系MCF-7培养在含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液中,37℃、5%CO2培养箱中培养。实验组用 0.2μg/L 的 TGF-β1处理72h,细胞80%融合时用于实验。

2.2 细胞形态学观察

光学显微镜下观察未处理组及 0.2μg/L的TGF-β1处理72h后细胞形态学的改变。

2.3 Transwell侵袭小室体外侵袭实验

参照Ries等[4]的方法,取 Transwell小室放入24孔板中,小室滤膜的上方加重组细胞基底膜(Matrigel)20μg形成基质胶层,之后将细胞制成单细胞悬液,细胞以 1×105/cm2密度,每孔 200μl接种于 Transwell膜上,并在 Transwell下室中加入含 0.2μg/L 的 TGF-β1的 RPMI1640 培养基作为趋化剂 ,每孔 600μl。于 37 ℃、5%CO2培育 48h 后 ,吸取 Transwell小室中的培养液,以棉签轻轻拭去微孔膜上层的细胞,保留侵袭至微孔膜下表面的细胞,用冰甲醇固定1min后 HE染色。于高倍镜(×200)下计数穿过基质膜滤膜底面的细胞数。

2.4 免疫细胞化学方法检测细胞内 E-cadherin、Vimentin及 Snail的表达

将未处理组及0.2μg/L的 TGF-β1处理72h后的MCF-7细胞接种于涂有多聚赖氨酸的玻片上,贴壁后,取出玻片,用预冷的丙酮固定细胞5min,PBS冲洗3次,加入稀释的一抗孵育30min,PBS冲洗3次,加入二抗孵育30min,PBS冲洗3次,加入三抗孵育30min,PBS冲洗3次后DAB显色。结果判定参照文献采用半定量积分法[5]:高倍镜下连续观察5个高倍视野,以阳性细胞数所占比例小于5%为0分,5%-25%为1分,26%-50%为2分,51%-75%为3分,大于75%为4分。染色强度:以无染色为0分,淡黄色为1分,黄或深黄色为2分,褐色或棕褐色为3分。两项积分相乘大于4分为阳性。实验重复3次,取其均值作统计学分析。

2.5 免疫荧光方法检测细胞内 E-cadherin、Vimentin及Snail的表达

将未处理组及0.2μg/L的 TGF-β1处理72h后的MCF-7细胞制作细胞爬片,在甲醇及丙酮(体积比3∶1)新鲜配置的混合冷固定液中固定20min后,用蒸馏水洗2次后,加入 H2O2封闭30min,PBS洗3次每次5min,然后加一抗4℃过夜,PBS洗三次,每次5min,滴加Cy3标记的羊抗兔 IgG作为二抗37℃孵育30min,PBS洗三次后,滴加DAPI(复染细胞核,呈蓝色荧光)室温孵育5min。荧光显微镜下观察。用PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定同免疫细胞化学采用的半定量积分法。

2.6 real time PCR 检测细胞内 E-cadherin、Vimentin及Snail mRNA的表达

Trizol法提取细胞中的总 RNA,逆转录合成cDNA,real time PCR检测样本中的 E-cadherin、Vimentin及Snail cDNA水平,β-actin基因做内参照。引 物:Snail(799bp):5’-CCACTATGCCGCGCTCTTT-3 ’ (up),5 ’-TCA GCGGGGACATCCTGA GCA-3’(down);E-cadherin(377bp):5’-A TCCAAAGCCTCAGGTCATAAACA-3’(up),5’-AAGAAACAGCAAGA GCA GCAGAA T-3’(down);Vimentin(690bp):5’-CGC TTC GCC AAC TAC AT-3’(up)5’-AGG GCA TCC ACT TCA CAG-3’(down);β-actin(116bp):5’-TGGATCAGCAAGCAGGAGTA TGACGA GT-3’(up),5’-CGCAAGTTAGGTTTTGTCAAGAAAGGGT-3’(down)。反应在 25μl的体系中进行,其中 iQ SYBR Green Supermix 12.5μl、10μmol/L 的上下游引物各 1μl、样本 cDNA2μl(300ng)、RNA 酶灭活水8.5μl。热循环条件如下:Snail:94℃30s→(94℃15s→55℃30s→68℃30s40cycle)→68℃5min。E-cadherin:94℃30s→(94℃15s→57℃30s→68℃30s38cycle)→68℃5min。β-actin作为内参照同时扩增。按公式计算样本中 Snail、E-cadherin、Vimentin mRNA的相对表达量。

3.统计学分析

采用 SPSS13.0软件分析数据,不同组细胞Snail、E-cadherin、Vimentin 蛋白及 mRNA 表达水平的比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.细胞形态学的改变

光学显微镜下观察 0.2μg/L 的 TGF-β1处理72h后的MCF-7细胞发现与未处理组细胞相比,细胞突起不同程度的增多,细胞变得细长,细胞融合度降低(见图1)。

2.免疫细胞化学染色及免疫荧光观察MCF-7细胞中Snail、E-cadherin及Vimentin蛋白的表达

Snail主要表达于MCF-7细胞的细胞核中,呈棕黄色颗粒状(见图2),免疫荧光显示红色(图3)。0.2μg/L 的 TGF-β1处理 72h 后的 MCF-7 阳性细胞积分(5-6分)明显高于未处理组的阳性细胞积分(1分),差异有统计学意义。

图1 TGF-β1处理前后MCF-7细胞形态学的改变 ×200Fig. 1 Morphological changes of TGF-β1treated and untreated MCF-7 cells×200

E-cadherin主要表达于MCF-7细胞的细胞膜及细胞浆中,呈棕黄色、颗粒状(见图2),免疫荧光显示红色(图 3)。0.2μg/L 的 TGF-β1处理 72h后的MCF-7阳性细胞积分(5-6分)明显低于未处理组的阳性细胞数(2-3分),差异有统计学意义。

Vimentin主要表达于 MCF-7细胞的细胞浆中,呈棕黄色、颗粒状(见图2),免疫荧光显示红色(图 3)。0.2μg/L 的 TGF-β1处理 72h后的 MCF-7阳性细胞积分(3-4分)明显高于未处理组的阳性细胞积分(2分),差异有统计学意义。

3.TGF-β1增强了MCF-7细胞的体外侵袭能力

图2 免疫组化显示 TGF-β1处理前后细胞内Snail、E-cadherin、Vimentin的改变 ×200图3 免疫荧光显示 TGF-β1处理前后细胞内Snail、E-cadherin、Vimentin的改变 ×200Fig.2 Changes of Snail,E-cadherin and Vimentin in cells by immunohistochemistry ×200Fig.3 Changes of Snail,E-cadherin and Vimentin in cells by immunofluorescence ×200

Transwell小室侵袭实验结果显示用 TGF-β1做诱导剂的MCF-7细胞穿透到滤膜下的细胞数显著增加,未处理组 MCF-7细胞的穿透数为94±3个,用 TGF-β1做诱导剂的MCF-7细胞的穿透数为176±7个,差异有统计学意义。TGF-β1显著促进了MCF-7细胞在体外的侵袭能力。

4. 细胞中 Snail、E-cadherin及 Vimentin mRNA的表达

Real-time PCR检测将未处理组MCF-7细胞中 E-cadherin、Vimentin、Snail mRNA 与β-actin mRNA的比值分别作为1,与未处理组细胞相比,TGF-β1做诱导剂的 MCF-7 细胞 Snail(2.012)、Vimentin(2.125)mRNA 表达明显升高 (P<0.05);E-cadherin mRNA表达明显降低(0.569)。

讨 论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率逐年增加,尽管临床研究已经取得了较大的进步,但是其转移及复发率仍然很高,乳腺癌预后已成为临床研究的热点问题[6]。EMT指上皮细胞在特定生理和病理情况下向间充质细胞转化的想象。在胚胎发育、组织成形、伤口愈合、慢性炎症和多种纤维化疾病中,EMT发挥了重要作用[7]。肿瘤细胞在晚期常在细胞因子(TGF-为最常见)等作用下发生EMT而发生浸润及转移[8]。EMT主要的表现包括细胞间失去粘附和极性,骨架重塑,酶解基底膜发生转移。本实验形态学结果显示细胞突起不同程度的增多,细胞变得细长,细胞融合度降低,而免疫组化及免疫荧光结果显示 TGF-1作用后能证明细胞发生EMT的相关基因如 E-cadherin明显降低、而vimentin明显升高,表明TGF-1能有效的促进乳腺癌细胞发生EMT。

TGF-是一类多功能的细胞因子,能以自分泌、旁分泌方式调节多种细胞的生物学功能,包括抑制上皮细胞、免疫细胞和造血细胞的增殖,诱导血管生成。目前国外研究发现 ,TGF-[9]、NF-κB、Ras/MAPK等所介导的信号通路能诱导Snail表达,而糖原合成酶激酶-3则能通过抑制 NF-κB而抑制Snail表达[10]。Snail是存在于果蝇、鼠、人等生物体内的一种碱性螺旋-环-螺旋转录因子,包括三个典型和一个非典型的锌指结构区的锌指结构,属于锌指蛋白家族成员。在胚胎发育期间,Snail表达于原肠胚两侧细胞并参与了其发生EMT,进而迁移形成中胚层的过程,且能抑制外胚层来源基因的表达[11]。既往的研究表明:转录因子Snail高表达于乳腺癌[12]、胃癌[13]、肝癌[14]、结肠癌[15]中 ,并与乳腺癌组织学分级、淋巴结转移密切相关。Snail能作用于启动子上 E-boxes连接基序,直接抑制 E-钙粘素等上皮粘附位点成分转录,使细胞间粘附紊乱。本实验用 TGF-1诱导了MCF-7细胞发生EMT,发生 EMT的MCF-7细胞 Snail表达明显增强,表明Snail在 TGF-1诱导乳腺癌细胞发生 EMT中起着重要的作用。

本研究用 0.2μg/L 的 TGF-1处理 MCF-7细胞72h后即可见MCF-7细胞形态发生了明显变化,表现为细胞变得细长,伪足增多;同时 Vimentin,Snail蛋白及mRNA表达明显增高而E-cadherin蛋白、mRNA表达降低;Transwell小室侵袭实验提示细胞转移潜能明显增强。以上结果表明:TGF-1可能是通过调控转录因子Snail的表达使细胞发生了表型的转化以及增强转移潜能。

[1]Bettula VL,Evans KW,Hollier BG,et al.Epithelialmesenchymal transition-derived cells exhibit multilineage differentiation potentialsimilar to mesenchymalstem cells.Stem Cells,2010,28(8):1435-1445

[2]Thomson S,Buck E,Petti F,et al.Epithelial to mesenchymal transition is determinant of sensitivity of nonsmall cell lung carcinoma cell lines and xenografts to epidermal growth factor receptor inhibition.Cancer Res,2005,65(20):9455-9462

[3]Peinado H,Quintainlla M,Cano A. Transforming growth factor beta-1 induces snail transcription factor in epithelial cell lines:mechanisms for epithelial mesenchymal transitions.J Biol Chem,2003,278(23):21113-21123

[4]Ries C,Egea V,Karow M,et al.MMP-2,MT1-MMP,and TIMP-2 are essential for the invasive capacity of human mesenchymal stem cells:differential regulation byinflammatory cytokines.Blood,2007,109(9):4055-4063

[5]Half E,Tang X M,Gwyn K,et al.Cyclooxygenase-2 expression in human breast cancer and adjacent ductal carcinoma in situ.Cancer Res,2002,62(6):1676-1681

[6]王丹,齐凤杰.EphA2和 E-cadherin在乳腺癌中的表达及其与患者预后的关系.中国组织化学与细胞化学杂志,2010,19(1):66-71

[7]Radisky DC. Epithelial-mesenchymal transition.Cell Sci,2005,118(19):4325-4326

[8]Zavadil J,Bttinger EP.TGF-beta and epithelial-to-mesenchymal transitions.Oncogene,2005,24(37),5764-5774

[9]Peinado H,Quintanilla M,Cano A. Transforming growth factor beta-1 induces snail transcription factor in epithelial cell lines:mechanisms for epithelial mesenchymal transitions.J Biol Chem,2003,278(23):21113-21123

[10]Bachelder RE,Yoon SO,Franci C,et al. Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription:implications for the epithelial-mesenchymal transition.J Cell Biol,2005,168(1):29-33

[11]Fritzenwanker J H,Saina M,Technau U.Analysis of forkhead and snail expression reveals epithelial-mesenchymal transition during embryonic and larval development of Nematostella vectensis.Dev Biol,2004,275(2):389-402

[12]Come C,Amoux V,Bibeau F,et al.Roles of the transcription factors snail and slug during mammary morphogenesis and breast carcinoma progression.J Mammary Gland Biol Neoplasia,2004,9(2):183-193

[13]Natalwala A,Spychal R,Tselepis C.Epithelial-mesenchymal transition mediated tumourigenesis in the gastrointestinal tract.World J Gastroenterol,2008,14(24):3792-3797

[14]Min AL,Choi J Y,Woo HY,et al.High expression of Snail mRNA in blood from hepatocellular carcinoma patients with extra-hepatic metastasis.Clin Exp Metastasis,2009,26(7):759-767

[15]Larriba MJ,Martín-Villar E,GarcíaJM,et al. Snail2 cooperates with Snail1 in the repression of vitamin D receptor in colon cancer. Carcinogenesis,2009,30(8):1459-1468.

TGF-β1affect expression of snail in breast cancer

Yin Chonggao,Li Hongli1,Li Wentong2,Sun Yonghong3,Zhang Baogang2＊

(Department of N ursing;1Medicine Research Ex periment Center of Science Research;2Department ofPathology,Weif ang Medical College;

Objective To detect the expression of the zinc finger transcription factor snail after TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition(EMT),and investigate the role of snail in EMT and the development of breast cancer. Methods TGF-β1induced EMT in routinely cultured breast cancer cell line MCF-7. The invasive and metastatic capacity was evaluated with transwell migration assay.The expressions of E-cadherin,vimentin and snail protein and mRNA were investigated by real time PCR,immunohistochemistry and immunofluorescence. Results TGF-β1significantly decreased the expressions of E-cadherin protein and mRNA,but increased the expressions of Vimentin and snail protein and mRNA.The cellular invasion assay indicated that TGF-β1drastically enhanced the invasive potential of MCF-7. Conclusion E-cadherin and Vimentin are important biological markers of EMT.Snail may regulate the expressions of E-cadherin and Vimentin protein at the transcriptional level.Snail plays an important role in EMT and the development of breast cancer.

TGF-β1; Breast tumor; Epithelial-mesenchymal transition; Snail

R329.24;Q291

A

10.3870/zgzzhx.2011.02.0043Department ofPathology,af f iliated hospital of Weif ang Medical College,Weif ang261053,China)

2010-09-10

2011-04-01

国家自然科学基金(81072068),山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2010yy071),山东省潍坊医学院青年教师启动基金(KQ07037)

尹崇高,男(1979年),汉族,讲师。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)