液相色谱法测定注射用维库溴铵的有关物质

吴水仙 王咏 陈勇将

浙江仙琚制药股份有限公司 317300

液相色谱法测定注射用维库溴铵的有关物质

吴水仙 王咏 陈勇将

浙江仙琚制药股份有限公司 317300

目的 ：建立注射用维库溴铵有关物质的检测方法。方法：采用反相HPLC法，色谱柱为Agilent Eclipse XD（BC-18, 250×4.6 mm, 5 μ m），流动相为：pH为6.5的18.0 g·L-1的四甲基氢氧化铵的溶液－甲醇－乙腈（50：250：700），流速1.5 ml·min-1，柱温40 ℃，进样量20 μL，检测波长为210 nm。稀释剂：乙腈：0.01mol·L-1盐酸溶液(1：1)；结果：杂质A、杂质C和杂质E的检测限都为0.007%、杂质D和维库溴铵的检测限为0.006%, 定量限为0.02%，柱温、流速、流动相比例经过微小变化不影响检测结果。结论：本方法灵敏度高，准确度高，可用于注射用维库溴铵有关物质的检测。

注射用维库溴铵；有关物质；反相高效液相色谱法

Vecuronium Bromide for injection; Related substance; RP-HPLC

维库溴铵为单季铵类固醇类中效非去极化肌松药，临床上主要作为全麻辅助用药，用于全麻时的气管插管及手术中的肌肉松弛；根据维库溴铵的结构（图1）分析及生产工艺，主要的杂质有降解物（杂质C：3-水解物(Piperidinium, 1-[(2 β,3α,5α,16β,17β)-17-acetyloxy-3-hydroxy-2-(1-piperidinyl) androstan-16-yl]-1-methyl bromide)； 杂质D：3,17- 水解物(Piperidinium,

1-[(2β,3α,5α,16β,17β)-3,17-dihydroxy-2-(1-piperidinyl)androstan-16-yl]-1-methyl bromide)，杂质E：17-水解物(Piperidinium,

1-[(2 β,3 α,5 α,16 β,17 β)-3-acetyloxy-17-hydroxy-2-(1-piperidinyl) androstan-16-yl]-1-methyl bromide)）和中间产物杂质A（双酯物：3α,17β-diacetyloxy-2 β,16 β-bispiperidinyl-5 αandrostan）；为了对其进行质量控制，我们按药品质量标准分析方法验证指导原则和ICH杂质研究指导原则(1)(2)，建立了注射用维库溴铵有关物质的检测方法。经过方法验证证明该方法灵敏度高、专属性好、准确度高。维库溴铵结构见图1。

图1 维库溴铵结构

1 仪器与试药

仪器：岛津LC-20AD高效液相色谱仪(日本 岛津公司)；CP225D天平（德国 赛多利斯公司）；

试药：维库溴铵及注射用维库溴铵由浙江仙琚制药股份有限公司提供、维库溴铵系统适用性对照品购自欧洲药典会；杂质A、杂质C、杂质D和杂质E购自美国药典会。乙腈、甲醇为色谱纯（Tedia 公司）；盐酸和四甲基氢氧化铵为分析纯，均为国产；水为注射用水（公司制备）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB C-18 柱,（250×4.6 mm, 5 μ m）。

检测波长: 210 nm

柱温：40 ℃

流速：约1.5 ml/min

稀释剂：乙腈：0.01 mol·L-1盐酸溶液(1：1)

流动相：pH为6.5的18.0 g·L-1的四甲基氢氧化铵的溶液－甲醇－乙腈（5 0：250：700）

运行时间：25min

2.2 溶液制备

对照液（a）：取约4mg维库溴铵EP系统适用性对照品（含杂质A、E、C、D），用2mL稀释剂溶解。

对照液（b）：取供试液1mL到50mL量瓶中，加稀释剂稀释至刻度。

供试品溶液：取注射用维库溴铵样品1支，加2mL稀释剂溶解，摇匀,即得。

空白辅料溶液：取1支没有加主药的空白样品，加2ml稀释剂溶解，摇匀，即得。

2.3 系统适用性试验及专属性

对照品溶液（a）和空白辅料溶液和供试溶液按“2.1”色谱条件进样，维库溴铵与各杂质峰之间、维库溴铵和辅料峰之间都能有效分离。结果见图2。

图2 维库溴铵系统适用性、样品及空白辅料色图谱

Ⅰ-维库溴铵系统适应性色谱图，Ⅱ-维库溴铵样品色谱图，Ⅲ-空白辅料色谱图

2.4 定量限、检测限试验

分别取杂质A、杂质C、杂质D、杂质E和维库溴铵适量，配制成一定浓度的溶液，照“2.1”项下色谱条件进样两针，计算S/N值，平均信噪比为10左右，即为定量限浓度（杂质A、杂质C、杂质D、杂质E和维库溴的定量限都为0.02%）；取定量限下的溶液3 mL，用稀释剂稀释至10 ml，照“2.1”项下色谱条件进样两针，计算S/ N值，平均信噪比为3左右，即为检测限浓度（杂质A、杂质C和杂质E的检测限都为0. 007%、杂质D和维库溴的检测限为0.006%）。

2.5 方法重复性试验：取注射用维库溴铵样品1支，加2 mL稀释剂溶解，摇匀，配制6份。单个主杂质的RSD为5.8%，杂质总量的RSD为4.2%。

2.6 中间精密度试验：由两人分别在不同的仪器上按要求测试样品，连续测试三天，计算每次测试样品的杂质含量，并计算每个测试条件所得杂质含量的平均值与RSD。检测结果：主杂质在0.30%～0.34%之间，平均值为0.32%，RSD为6.5%；杂质总量在0.62%～0.69%之间，平均值为0.65%，RSD为4.3%。

2.7 溶液稳定性：取注射用维库溴铵样品1支，加2 mL稀释剂溶解，分别在如下时间点进样供试品溶液进行测试：0、2、4、8、12小时；计算每个时间点的杂质及相应的变化。结果表明，供试品溶液在2个小时后，杂质就明显开始增大，故在检测时需临用新配。

2.8 耐用性试验：曾用不同的流动相比例、不同的流速、不同的柱温，维库溴铵与各杂质峰之间能较好地分离，能满足系统适用性要求；改换不同型号色谱柱，其色谱峰分离度不理想，故建议选用（Eclipse XDB C-18, 250×4.6 mm, 5 μm）色谱柱。

2.9 样品检测：取本公司的样品3批和进口样品1批，按本试验所用方法进行测定，样品检测结果见表1。

表1 维库溴铵样品检测结果

3 讨论

1）杂质量的计算方法：参照EP维库溴铵有关物质项(3)下和本次验证对各杂质相对校正因子的计算结果，杂质A=0.6；杂质C=1. 4。因而采用加校正因子的自身对照法计算计算杂质A和杂质C的含量（计算杂质A和杂质C组分时, 峰面积乘以校正因子）。

2）检测波长：维库溴铵及其各杂质均没有共轭双键，在紫外区没有强吸收，根据紫外扫描图谱，在210 nm的末端紫外区有吸收，且各组分的响应值差异不大，因而选择210 nm为检测波长。

3）溶剂选择：维库溴铵及各杂质组分在甲醇与乙腈中易溶，注射剂中的辅料易溶于水，考虑到维库溴铵pH值在2～3的范围内相对稳定，因而选取乙腈－0.01 mol·L-1盐酸溶液(1：1)为稀释剂。

[1]2010年版中国药典附录ⅪⅩ .A药品质量标准分析方法验证指导原则

[2]International conference on harmonisation. ICH harmonized tripartite guideline impurities in new drug substances Q3A(R2).8～11

[3]EUROPEAN PHARMACOPOEIA 7.0 ,volume 2

Determination of related substance in Vecuronium Bromide for injection by HPLC

Wu Shuixian Wang Yong Cheng yongjiang
Zhejiang Xianju Pharmaceutical Co., ；Ltd317300

OBJECTIVE To establish a RP-HPLC method for the determination of related substance in Vecuronium Bromide for injection. METHODS The analysis was carried out on an Agilent Esclipe XDB-C18，column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), using water (pH 6.5, 18.0 g/L的四Tetramethylammonium hydroxide Beilstein)–methanol-acetonitrile (50:250:700) as the mobile phase at a flow rate of 1.5 mL/min-1 at 40 ℃, injection volume was 20 μ L and detected wavelength was 210 nm, diluent was mixture solution of acetonitrile-0.01 mol/L HCl (1: 1). RESULTS Each LOD of impurity A, impurity C and impurity E was 0.007%, the LOD of impurity E and Vecuronium Bromide was 0.006%; there was no influence on sample testing when small changes were made in the chromatographic conditions (column temperature, flow rate, and proportion of mobile phase). CONCLUSION The method was sensitive, and accurate, and it was suitable for the determination of related substance in Vecuronium Bromide.

10.3969/j.issn.1001-8972.2011.14.014