草鱼盐溶蛋白凝胶结构与质构特性研究

董 哲，杨玉玲，王素雅，马 云，顾婷婷，杨智伟

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏南京210003）

草鱼盐溶蛋白凝胶结构与质构特性研究

董 哲，杨玉玲﹡，王素雅，马 云，顾婷婷，杨智伟

（南京财经大学食品科学与工程学院，江苏南京210003）

分析了草鱼盐溶蛋白的组成成分，对其凝胶微观结构进行了观察，并采用L9（34）正交实验研究了盐溶蛋白凝胶的质构特性，以期为草鱼肉糜制品加工提供一些理论参考。结果显示，盐溶蛋白主要由肌球蛋白重链、肌动蛋白和两条肌球蛋白轻链组成，分子量分别为190、53、30、17kDa。盐溶蛋白凝胶呈粗糙的三维网络结构。各因素对凝胶硬度和弹性的影响顺序为：蛋白浓度＞离子强度＞Ca2+。盐溶蛋白凝胶硬度的最优组合为蛋白浓度24mg/mL、Ca2+浓度为0.08mol/L、离子强度为0.6。凝胶弹性的最优组合为蛋白浓度24mg/mL、Ca2+浓度为0.08mol/L、离子强度为0.5。

草鱼盐溶蛋白，组分，微观结构，凝胶，质构

草鱼是我国鱼类中最常见的品种，每年产量在220万t以上，居我国鱼类养殖品种的首位。盐溶蛋白（SSP）是鱼肉中的主要蛋白质（55%～60%），包括肌球蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白和肌钙蛋白等[1]。盐溶蛋白的凝胶特性对肉制品的品质有很重要的影响，例如它的质构特性影响鱼肉制品的硬度、弹性和嫩度等。影响蛋白凝胶特性的因素有很多，主要有离子强度及其类型、蛋白质浓度、pH、温度、肌肉类型等。白云等人发现兔肌球蛋白凝胶的硬度和弹性随蛋白浓度的增加而增加[2]。Hermansson等指出，肌球蛋白在低离子强度下（0.25mol/L KCl）形成链状凝胶结构，而在高离子强度下（0.6mol/L KCl）形成粗糙的凝胶结构，并认为凝胶的质构特性很大程度上受凝胶结构的影响[3]。邓丽和芮汉明报道了0.6%的Ca2+能够显著提高凝胶硬度，但对凝胶弹性影响不大[4]。赵春青等人研究表明CaCl2对鸡肉盐溶蛋白凝胶硬度有显著影响[5]。于巍和周坚研究了草鱼盐溶蛋白流变性质及凝胶保水性[6]。在我国，草鱼深加工水平较低，主要以鲜活类型销售，限制了草鱼的养殖业发展。目前我国对于草鱼蛋白已有些许研究，但是对于草鱼盐溶蛋白凝胶质构特性的研究还未见报道。本文研究了草鱼盐溶蛋白凝胶结构和质构特性，以期为草鱼肉糜制品品质的提高提供一些理论参考，促进草鱼制品的开发，提高其附加值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜草鱼 市售；NaCl、NaN3、Na5P3O10、CuSO4、NaOH等试剂 均为分析纯；标准蛋白 SIGMA。

722 可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；GL-20B型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；XT.Plus.TA，Stable Micro Sydtems UK；KTApurifier explorer 100Sweden；日立-S-3000N扫描电子显微镜 Japan；蛋白纯化仪，1210/300GL色谱柱。

1.2 实验方法

1.2.1 草鱼盐溶蛋白提取工艺 将新鲜鱼肉去皮去刺后制成肉糜，将肉糜放入高速捣碎机中，加入4倍体积的洗液（0.1mol/L NaCl，1mmol/L NaN3）作匀浆处理。搅打6次，每次10s，间隔10s。将制成的匀浆离心（4000×g，20min）弃去上清液，得沉淀，重复上述操作步骤一次。得到的沉淀溶解于4倍体积的提取液中（适量NaCl，1mmol/L NaN3，0.01mol/L Na5P3O10），搅拌均匀，4°C静置过夜。将匀浆液用2层纱布过滤，去掉结缔组织，得到的滤液用稀释液（1mmol/L NaN3，pH=7.4）稀释10倍。稀释后离心（10000×g，30min），得到的沉淀即为盐溶蛋白。

1.2.2 蛋白浓度的测定 采用双缩脲法在540nm下测定蛋白溶液的吸光度，以牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白[6]。

1.2.3 测定提取液中NaCl的最优添加量 通过调整NaCl的添加量来设计提取液中离子强度分别为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8，提取后测定不同离子强度下SSP的提取率。提取率=W1/W2，其中W1：SSP质量；W2：鱼肉总质量。

1.2.4 盐溶蛋白组分的测定 将样品用流动相（0.25mol/L NaCl，50mmol/L磷酸盐缓冲液，pH=7.0）调整为2mg/mL，进样量50μL，设定流动相流速为0.25mL/min，在280nm下测定样品吸收峰。

1.2.5 正交实验 选用L9(34)正交表进行正交实验，因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表

1.2.6 凝胶的制备 根据实验设计配制不同条件的盐溶蛋白溶液。水浴加热到45°C时保温15min，继续升温至75°C，加热速度为1°C/min。取出，冷却至室温，在4°C放置2h，即得凝胶。

1.2.7 质构特性的测定 使用质构仪测定凝胶的硬度和弹性，测定条件：选用P/6探头，测试前速度为5.00mm/s，测试速度为1.00mm/s，测试后速度为5.00mm/s，探头深入距离为10mm。每个样品重复三次，取平均值。

1.2.8 凝胶微观结构观察 SSP凝胶加热制成后冷却至室温，浸入20%的戊二醛溶液，备用。在15kV下，放大3000倍观察凝胶的微观结构。

2 结果与分析

2.1 提取液离子强度的确定

提取液离子强度对盐溶蛋白提取率的影响见表2。由表2可得，当提取液离子强度为0.6时，SSP的提取率最高为4.73%，所以确定在盐溶蛋白提取工艺中提取液的离子强度为0.6。

表2 提取液离子强度对提取率的影响

2.2 盐溶蛋白组分的测定

图1 盐溶蛋白组分280nm吸收峰图谱

图1中，A、B、C、D四个点位标准蛋白分子量分别为200、130、66、43kDa。由蛋白纯化仪分析样品可以得出，草鱼盐溶蛋白主要有四个组分，分子量分别为190、53、30、17kDa，依次可能为肌球蛋白重链、肌动蛋白和两条肌球蛋白轻链。Iwami和Tao分别研究了马苏大马哈鱼的肌球蛋白和草鱼快肌的肌球蛋白，得到了相似的结论[7-8]。

2.3 凝胶微观结构的观察

图2 凝胶的微观结构

由图2可以看出，凝胶形成粗糙的三维网络结构，交联紧密，孔洞分布不均匀，孔径有大有小。Boyer等人发现，兔肌原纤维蛋白在高离子强度下也形成较粗糙的三维网状结构[9]。

2.4 SSP凝胶特性分析

2.4.1 各因素对SSP凝胶弹性和硬度的影响

2.4.1.1 SSP浓度对凝胶弹性和硬度的影响 由图3和图4可以看出，在一定范围内，随着盐溶蛋白浓度的提高，其凝胶硬度和弹性均呈直线性增加。二者趋势线方程分别为y=3.2713x-35.92，R2=0.9541；y=0.0595x-0.5674，R2=0.9751。SSP浓度的增加使蛋白分子间的间距变小，分子与分子更容易相互作用，因此增加了蛋白间凝聚的机会，交联数目增加，因此凝胶硬度不断提高，SSP凝胶弹性变化趋势与硬度的相似，在蛋白加热变性过程中蛋白分子链充分交联，把自由水包埋在其中，形成立体网络结构，较好的网络结构就会有较高的弹性[10]。

图3 SSP浓度对凝胶硬度的影响

图4 SSP浓度对凝胶弹性的影响

图5 Ca2+对凝胶硬度的影响

2.4.1.2 Ca2+对SSP凝胶硬度、弹性的影响 由图5和图6可以看出：随着Ca2+浓度的增加，SSP凝胶硬度呈直线上升，当Ca2+添加量达到0.10mol/L时，比不添加时凝胶的硬度增加1倍。而其弹性则随着Ca2+浓度的增加有所波动，当Ca2+浓度在0.06mol/L时达到最小值，在0.10时达到最大值。一定浓度的Ca2+在适当温度下能够激活蛋白中的转谷氨酰胺酶（TGase），催化谷氨酸残基的γ-羧基酰胺基团与其它氨基酸残基发生交联作用，使蛋白分子链间形成致密的网络结构[11-13]。

图6 Ca2+对凝胶弹性的影响

2.4.1.3 离子强度对SSP凝胶硬度、弹性的影响 由图7和图8可知，离子强度在0.6时凝胶硬度达到最大，而随着离子强度的增大，凝胶硬度逐渐降低。在一定的范围内，随着蛋白溶液离子强度的增加，凝胶硬度增加，这是由于盐溶液能使盐溶蛋白上的负电荷增加，蛋白分子间的斥力加强，间距加大；另一方面，高浓度的盐打破了维持肌球蛋白、肌动蛋白，Z线、M线之间相互连接的力，这些正是限制肌原纤维膨胀的作用力。当盐溶蛋白溶液离子强度过高时，凝胶硬度逐渐下降，这可能是由于凝胶脱水引起的[14-16]。同时，离子强度在0.5时凝胶弹性达到最大，随后弹性随着离子强度增加先减小后增大。

图7 离子强度对凝胶硬度的影响

图8 离子强度对凝胶弹性的影响

2.4.2 盐溶蛋白凝胶特性正交实验分析 根据以上实验结果，采用蛋白浓度、Ca2+浓度、离子强度作为三因素，以盐溶蛋白凝胶硬度和弹性为指标，进行正交实验分析，结果见表3。

由表3可知，第9号实验（A3B3C1）得到的盐溶蛋白凝胶硬度和弹性皆为最大值，即离子强度为0.6、Ca2+浓度为0.08mol/L、蛋白浓度为24mg/mL。

表3 凝胶质构特性正交实验结果

表4 以硬度为指标的极差分析

通过硬度的极差分析（表4）可以看出，各因素的最优组合为A3B3C1，这与直观分析最大值所得到的最优组合一致，所以确定获得凝胶硬度的最优组合为A3B3C1。各因素对凝胶硬度的影响程度顺序为：蛋白浓度＞离子强度＞Ca2+浓度。

表5 以弹性为指标的极差分析表

通过弹性的极差分析（表5）可以看出，各因素的最优组合为A3B2C1，这与直观分析弹性最大值得到的最优组合A3B3C1不一致，所以需要进一步验证实验。各因素对凝胶弹性的影响程度顺序为：蛋白浓度＞离子强度＞Ca2+浓度，这与硬度的影响顺序是一致的。

2.4.3 验证实验 选择A3B2C1做验证实验，重复测三次，得到弹性平均值为0.93，所以确定弹性的最优组合为A3B2C1。

3 结论

盐溶蛋白主要组分为肌球蛋白重链、两条肌球蛋白轻链和肌动蛋白，分子量分别为190、53、30、17kDa。凝胶微观结构为粗糙的三维网络状。不同因素对草鱼盐溶蛋白凝胶质构影响程度顺序为蛋白浓度＞离子强度＞Ca2+浓度。

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Study on gel microstructure and properties of salt soluble proteins from grass carp

DONG Zhe,YANG Yu-ling*,WANG Su-ya,MA Yun,GU Ting-ting,YANG Zhi-wei

（Food College,Nanjing University of Finance&Economics,Nanjing 210003,China）

The compositions of salt soluble proteins(SSP)from grass carp were determined and the microstructures of SSP gel were observed.Furthermore，gel properties of SSP from grass carp was studied with L9(34)orthogonal test.The results showed there were four minor compositions in SSP，including myosin heavy chain，actin and two myosin light chains.Their molecular weights were 190，53，30，17kDa，respectively.The microstructure of the SSP gel was coarse.The different factors that affected the SSP gel hardness and springiness were SSP concentration ＞ ionic strength ＞ Ca2+，in the order of influential extent.The best conditions for hardness were protein concentration 24mg/mL，Ca2+concentration 0.08mol/L，ionic strength 0.6；The best conditions for springiness of SSP gel were protein concentration 24mg/mL，Ca2+concentration 0.08mol/L，ionic strength 0.5.

SSP of grass carp；compositions；microstructure；gelation；textural properties

TS254.1

A

1002-0306（2011）10-0177-04

2010-09-08 *通讯联系人

董哲（1986-），女，硕士，研究方向：大分子蛋白性质。