产红色素酵母菌的分离、鉴定及其基础培养基的优化

李洁慧，单晓丽，宫春波，孙 涛

(青岛农业大学食品与科学工程学院，山东青岛266109)

产红色素酵母菌的分离、鉴定及其基础培养基的优化

李洁慧，单晓丽，宫春波*，孙 涛

(青岛农业大学食品与科学工程学院，山东青岛266109)

利用微生物平板分离方法，从花生渣土、椰汁土中分离、筛选得到3株产红色素菌株。光学鉴定发现菌体呈现椭球形，大小约为(2.5～5.0)μm×(5.5～8.0)μm;无性繁殖为出芽生殖。根据菌体形态特征、群体形态特征和生理生化反应，3株菌株归属于红酵母属(Rhodotorula)，命名为红酵母FS－1(Rhodotorula sp.FS－1)。依据OD值法、DCW法测得红酵母FS－1的典型生长曲线为:延滞期，0～8h;对数期，8～24h;稳定期，24～34h;衰亡期为34h后。红酵母 FS－1能够较好地利用豆芽汁蔗糖培养基作为其发酵基础培养基产生红色色素。

酵母菌，红色色素，基础培养基

色素作为一种重要的食品添加剂，在食品行业的应用越来越广泛，按来源通常分为合成色素、仿天然色素和天然色素［1］，天然色素因其具有高安全性、营养保健作用并能更好地呈现天然物质的颜色而越来越受到人们的关注。很多食品级安全的真菌、细菌等微生物在菌体生长过程中能产生不同颜色和结构的色素，为开发微生物源性食品着色剂提供了良好的来源。另外，微生物生长能够克服季节、气候等限制因素，利用发酵获得大量目标色素，因此研发微生物源性色素日益受到重视。酵母菌是一类单细胞的食品级安全真核微生物，以其结构简单、繁殖快速、相对于细菌更安全等优点被人们普遍接受并广泛用于工业生产中，利用酵母菌生产天然色素在食品添加剂行业中具有极其广泛的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

腐烂花生皮土壤、花生油渣土壤 采自莱阳花生油厂;椰子汁培育土壤 青岛农业大学园艺实验地;大豆粉、豆芽汁、玉米面 市售;培养基［2－4］分离培养基:PDA固体培养基，鉴别培养基:PDA培养基、麦氏培养基、麦芽汁琼脂培养基、无碳培养基、无氮培养基、缺维生素培养基、高渗透压培养基、产类淀粉培养基、脲素培养基、醋酸琼脂培养基、明胶液化培养基、碳酸钙培养基、产酯培养基;5%孔雀石绿染液，卢哥氏碘液，结晶紫染液，番红(沙黄)染液等其他常规试剂。

LXJ－Ⅱ型离心机、LXJ－Ⅱ离心沉淀机 上海医用分析仪器厂;SPX型智能生化培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;手提式压力蒸汽灭菌器 上海华线医用核子仪器有限公司;JY2002电子天平 上海精密科学仪器有限公司;超净工作台 苏净集团安泰公司;UV－2100分光光度计 尤尼科(上海)仪器有限公司;Anke Tall－16台式离心机 上海安亭科学仪器厂;摄像显微镜 BK－DM320。

1.2 实验方法

1.2.1 微生物的分离方法［5］称取土壤样本置于无菌水中，配制成不同稀释梯度的菌悬液，选择合适的稀释梯度，经平板分离初筛，挑取目标菌落转接种斜面培养基，备用。

1.2.2 菌种的鉴定方法 参考文献［2－6］中推荐的方法对菌株的菌落形态、细胞形态、有无假菌丝、生殖方式等形态学特征进行观察，利用碳源发酵、同化实验、37℃条件生长、高渗透压培养基生长、无维生素培养基生长、醋酸生长、产类淀粉、产酸、产酯、分解脲素、明胶液化等生理生化反应进行生理生化测定，并对照《酵母菌的特征与鉴定手册》初步鉴定目标菌株的归属。

1.2.3 生长曲线的测定［7］在装有80mL豆芽汁培养基的锥形瓶中按8%的接种量接入酵母菌的菌悬液，28℃、140r/min 振荡培养，培养后第 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、37、40、43、47、51、55h分别在560nm波长下以不接菌的培养液为空白对照测定其OD值。以培养时间为横坐标、相应的吸光度为纵坐标，绘制酵母菌生长曲线。

1.2.4 生物量的测定方法［8］OD值法:依据酵母菌的生物量与发酵液的吸光度呈正相关，在波长560nm处测定其吸光度(比色杯直径为1cm)，得OD560。

干细胞重法(DCW法):离心前将离心管放入鼓风干燥箱中烘干若干小时，自然冷却，分析天平称重。取5mL发酵液置于离心管中，4000r/min离心10min，弃上清，85℃烘干12h，称重，用差量法得干细胞重。

2 结果与分析

2.1 菌体的分离、纯化

从腐烂花生皮的土壤、花生油渣土和椰汁培育土壤中经平皿划线分离法，分别得到呈粉红色、淡黄色、橘红色，黏稠、湿润，表面平坦无褶皱，边缘整齐的菌落。挑取其中3株粉红色菌落作为筛选的目的菌株，分别编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，斜面冷藏保存备用。

2.2 菌体个体形态、群体形态观察

将菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在PDA固体培养基上点接种，28℃，72h培养，菌落均呈橘红色圆形菌落，菌落直径在1.5mm左右，中央略微隆起，质地均匀，无褶皱，边缘整齐，黏稠，隆起于培养基表面，易挑起，正反面颜色一致(图1)。菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在麦芽汁液体培养基中培养3d后，可看到发酵液呈现橘黄色，底部有橘红色沉淀物，静止沉淀后得到橘红色菌体沉淀物。

菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在光学显微镜1000倍下观察，细胞呈椭圆形，大小约为(2.5～5.0)μm ×(5.5～8.0)μm，无性繁殖方式为出芽生殖(图2);产孢培养基上获得的菌体，简单美蓝染色，光学显微镜1000倍下观察，能够推定菌株能在产孢子培养基上产生子囊孢子(图3);假菌丝实验和掷孢子形成实验表明，该菌株不产假菌丝，亦不产生掷孢子。

2.3 菌株生理生化特征及鉴定结果

图1 菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ豆芽汁固体培养基平板菌落特征

图2 光学显微镜下菌体个体形态及其出芽生殖(1000倍)

图3 产孢子培养基上产生子囊孢子(1000倍)

参照文献［2－4］，按照鉴定要求对菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ进行发酵实验、同化实验、产酯实验、产酸实验等。实验结果见表1，可知菌株能够以葡萄糖、蔗糖、甘露醇、半乳糖以及乙醇作为碳源，同化实验阳性;但发酵实验阴性;菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ可以利用硫酸铵、硝酸钾，37℃均能够生长，产酯不产酸。

表1 菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ生理生化鉴定结果

综合菌体的个体形态、群体形态和生理生化鉴定结果，对照《酵母菌的特征和鉴定手册》［2］分析，发现菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ属于同一种酵母菌，鉴定为红酵母属(Rhodotorula)，初步判定为一株红酵母(Rhodotorula sp.)，命名为红酵母 FS－1(Rhodotorulasp.FS－1)。

2.4 菌体生长曲线的测定及其结果

根据OD值法，红酵母FS－1生长曲线测定结果见图4;依据干细胞重法(DCW法)，红酵母FS－1生长曲线测定结果见图5。图4、图5表明，前8h酵母菌生长曲线趋于平缓，生长缓慢，处于菌体生长的延滞期;8～24h酵母菌的OD值、DCW值曲线增长迅速，呈现对数增长，为菌体生长的对数期;24～34h后菌体生长趋于稳定，生长曲线较平缓，说明菌体生长处在稳定期;34h后OD值、DCW值均呈现下降趋势，为菌体生长的衰亡期。在振荡培养的过程中发现，橘红色色素在34h后逐渐开始产生，符合微生物产次级代谢产物的一般规律［9］。DCW法测定的曲线趋势图与OD值法测定的曲线较吻合，相互印证了其生长规律。

图4 红酵母FS－1的典型生长曲线(OD值法)

图5 红酵母FS－1的典型生长曲线(DCW法)

2.5 发酵培养基的初步筛选结果

2.5.1 不同发酵基础培养基对红酵母FS－1生物量的影响 以PDA液体培养基、豆芽汁、麦芽汁培养基为发酵基础培养基，28℃、72h培养红酵母FS－1，测得的OD值和DCW值结果见图6，可以看出红酵母FS－1在3种基础培养基中的生物量差别不大，PDA液体培养基获得的酵母生物量较大，麦芽汁培养基次之，豆芽汁培养基较少，但差距并不显著。然而，就色素生产而言，豆芽汁培养基中的色素鲜亮、杂质少。另外，PDA液体培养基和麦芽汁培养基中含有大量沉淀物不易去除，且影响色素颜色及其后期提取、纯化。因此，综合考虑，选择豆芽汁培养基作为发酵基础培养基。

2.5.2 基础培养基不同碳源对红酵母FS－1生长的影响 以豆芽汁培养基为发酵基础培养基，测定葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖和甘露醇五种碳源对红酵母FS－1生物量的影响，结果见图7，表明将葡萄糖、半乳糖、蔗糖作为碳源时，红酵母FS－1生长的OD值差异不显著，而DCW值则以蔗糖为最大，并且72h时，各碳源的发酵基础培养基均有橘红色色素产生，由此确定蔗糖为红酵母FS－1发酵基础培养基的

图6 红酵母FS－1在3种发酵基础培养基中的生长情况最佳碳源。

图7 红酵母FS－1在不同碳源发酵基础培养基中的生长情况

3 讨论

运用微生物平板划线分离法，从腐烂花生皮土、花生油渣土以及椰汁培育土样中共分离到3株产橘红色色素菌株，通过菌体的个体形态特征、群体形态特征和生理生化鉴定结果，对照《Yeasts:Characterisitics and Identification》分析，确认分离到的菌株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ属于红酵母属(Rhodotorula)，初步判定为一株红酵母(Rhodotorula sp.)，命名为红酵母FS－1(Rhodotorula sp.FS－1)。酵母菌的生长趋势为0～8h为延滞期，8～24h 为对数生长期，24～34h 为稳定期，34h 后为衰亡期，这与蔡金星［10］、王秋菊［7］、陈龙泉［11］等人研究的酵母菌生长趋势基本吻合。本研究确定红酵母FS－1生长的最优碳源为蔗糖，这与王岁楼［12］、仓一华［13］、张琇［14］等人的研究结果一致。胡萍［15］、张卉［16］等人则发现葡萄糖为产类胡萝卜素酵母菌发酵的最佳碳源。在诸多研究中发现，葡萄糖和蔗糖对产类胡萝卜素酵母菌的生长影响差别不大，在工业生产中，为降低生产成本，通常选择葡萄糖为最佳发酵碳源。

［1］王飞，石晓，刘畅，等.一株细菌产紫红色素的稳定性研究［J］.食品工业科技，2009(12):332－335.

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Isolating and identifying red pigment produced starin and optimizing fermentation fountation medium

LI Jie－hui，SHAN Xiao－li，GONG Chun－bo*，SUN Tao

(College of Food Science and Engineering，Qingdao Agriculture University，Qingdao 266109，China)

Three prouduced red pigment strains were scaned by using the microorganism plate pure isolation technique from peanut dregs pollution soil，peanut oil dregs pollution soil and coconut milk pollution soil.The three isolated strains belonged to Rhodotorularby morphologicalfeature and physiology and biochemistry characteristics，it was called Rhodotorula sp.FS－1.Rhodotorula sp.FS－1 appeared to elliptocytosis，was(2.5～5.0)μm ×(5.5～8.0)μm.Rhodotorula sp.FS－1 asexual reproduction was budding.By determining turbidimetry(OD)and dry cell weight(DCW)，Rhodotorula sp.FS－1 growth curve was divided into four growth phase，respectively was lag phase 0～8h，exponential phase 8～24h，stationary phase 24～34h，death phase or decline phase behind 34h.The fermentation fountation medium of Rhodotorula sp.FS－1 for producing red pigment was bean sprouts medium with sucrose.

yeast;red pigment;fermentation fountation medium

TS201.3

A

1002－0306(2011)09－0227－04

2010－09－17 *通讯联系人

李洁慧(1987－)，女，在读硕士研究生，研究方向:食品微生物及发酵工程。