麦芽糊精基因组DNA不同提取方法的比较

徐伟丽，李启明，汪家琦，马 莺，*

(1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨150090;2.新希望乳业控股有限公司技术中心，四川成都610023)

麦芽糊精基因组DNA不同提取方法的比较

徐伟丽1，李启明2，汪家琦2，马 莺1，*

(1.哈尔滨工业大学食品科学与工程学院，黑龙江哈尔滨150090;2.新希望乳业控股有限公司技术中心，四川成都610023)

采用不同方法对麦芽糊精基因组DNA进行提取，从中选取满足麦芽糊精材料进行分子标记检测的最好的DNA提取方法。以市售麦芽糊精为材料，分别采用CTAB、SDS和异硫氰酸胍3种方法提取基因组DNA，比较不同方法的提取效果。光密度检测结果显示，异硫氰酸胍法的提取量和纯度均优于SDS法和CTAB法;琼脂糖凝胶电泳检测结果显示异硫氰酸胍法提取的基因组DNA谱带清晰、重复性好，SDS法和CTAB法提取的基因DNA观察不到谱带;3种方法提取的麦芽糊精基因组DNA都能够满足PCR分析的需要。结果表明，3种方法均能有效地从麦芽糊精中获得DNA，然而异硫氰酸胍法优于SDS法和CTAB法。

麦芽糊精，DNA提取

麦芽糊精被广泛应用在糖果、麦乳精、果茶、奶粉、冰淇淋、饮料、罐头及其他食品中，是各类食品的填充料和增稠剂。在健身食品中，它的主要作用是提供能量，使人快速增重［1］。由于麦芽糊精具有许多独特的性状特点，常常被作为乳品加工的主要填充增容材料，来提高牛乳的稠度和非脂固体的含量。一般来说，麦芽糊精的含量占奶粉比例的15%以下，虽然从一定程度来说对人体没有明显的害处，但是也会造成某些机能的缺失［2］。为了降低成本，其过量添加或违法添加均会相对地将乳粉中的蛋白质、乳脂类、乳糖、矿物质及各种维生素含量相应大大减少，添加物过多也会破坏食物成分的营养平衡，不利于消费者健康。现阶段对糊精的检测除了传统的生化方法［3－4］，食品安全工作者也期待能利用生物技术方法实现对其精准、快速的检测。PCR、Southern杂交等方法常常被用于物种品种和食品掺假的鉴定，这些技术的前提是需要获得高质量的核酸。到目前为止，关于麦芽糊精中的基因组DNA提取方法还没有报道。为此，本文以市售麦芽糊精为材料进行麦芽糊精DNA提取方法的研究，旨在探索一种快速、简便，能够满足PCR分析需要的麦芽糊精DNA提取方法，以期为今后利用生物技术方法进行食品检测奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

表1 PCR引物序列及扩增产物

表2 3种方法提取的麦芽糊精DNA的纯度和浓度

市售麦芽糊精(食品添加剂) 由齐齐哈尔大学食品科学与工程学院提供;异硫氰酸胍、十二烷基磺酸钠(SDS)、CTAB、Triton－X 100、Taq DNA 聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液(含Mg2+) 购自宝泰克生物科技有限公司;100bp ladder DNA marker 购自上海生工生物工程有限公司;CTAB抽提液组分 2%CTAB，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris HCl pH8.0;SDS抽提液组分 200mmol/L Tris－HCl(pH7.5)，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，0.5%SDS，0.1%β－巯基乙醇;异硫氰酸胍裂解液组分5mol/L 异硫氰酸胍(GuSCN)，0.05mol/L Tris－HCl(pH6.4)，0.02mol/L EDTA(pH 8.0)，1.3%Triton X－100;TE缓冲液组分 10mmol/L Tris－盐酸(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。

台式离心机、水浴锅、紫外分光光度计、梯度PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪 均为本实验室所有。

1.2 引物的合成

参照文献［5］合成18SrDNA片段的引物;参照文献［6－7］合成植物叶绿体rbcLDNA片段的引物;引物委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成(见表1)。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA提取方法

1.3.1.1 CTAB法 参照文献［8－9］并进行修改，步骤:a.将50mg样品加入600μL CTAB提取液中，65℃水浴30min，其间轻轻振荡2～3次。b.加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，颠倒混匀，静置 10min，12000r/min离心10min。c.将上清液转至新管中，加入0.8倍体积的异丙醇，轻轻混匀，－20℃放置10～20min。12000r/min 离心10min。d.弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀，室温晾干，加入30μL TE(pH8.0)溶解，－20℃保存备用。

1.3.1.2 SDS法 参照文献［10］并稍加改动，称取50mg样品置于1.5mL的离心管中，向管中加入600μL 65℃预热的SDS提取液，65℃水浴30min。添加600μL的氯仿/异戊醇(24∶1)，轻轻振荡，静置10min，12000r/min离心10min，取上清，加入0.8倍体积的异丙醇，－20℃放置10～20min，12000r/min离心10min。DNA沉淀用70%乙醇洗涤，室温晾干，加入30μL TE(pH8.0)溶解，－20℃下保存备用。

1.3.1.3 异硫氰酸胍法 参照文献［11－13］并稍加修改。称取50mg样品置于1.5mL离心管中，加200μL TE溶液(pH8.0)，旋涡混匀。加入400μL裂解液，旋涡混匀，室温静置20min。加入600μL氯仿/异戊醇(体积比24∶1)，剧烈振荡，12000r/min离心10min。取上清液，加0.8倍体积异丙醇，－20℃放置10～20min。12000r/min离心 10min。DNA沉淀用70%乙醇洗涤，室温晾干，加入30μL TE(pH8.0)溶解，－20℃下保存备用。

1.3.2 DNA纯度和浓度检测 吸取4μL DNA溶液，加入2mL蒸馏水，DNA母液被稀释501倍。混匀，转入分光光度计的石英比色杯中，用等体积的蒸馏水做空白对照。用紫外分光光度计测量260nm和280nm处的OD值，根据公式:DNA浓度=50×OD260×501(μg/μL)，计算 DNA 浓度;根据 OD260/OD280判断DNA的大致纯度。

将采用三种方法提取的麦芽糊精DNA各取5μL，与1μL 6 × Loading Buffer混匀，1.0% 琼脂糖凝胶电泳(100V，30min)，结果用紫外凝胶成像仪观察并拍照。

1.3.3 基因组DNA用于PCR扩增的适应性检测基因组DNA样品1μL做为模板，用18S核糖体RNA基因扩增，用引物进行PCR反应，反应体积为25μL。反应程序均为:94℃预变性3.0min;94℃变性30s，56℃退火 30s，72℃ 延伸 30s，35 个循环;72℃ 延伸5min。PCR产物用1.58%的琼脂糖凝胶进行电泳。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的纯度和浓度

从表2可以看出，异硫氰酸胍法和 SDS法的OD260/OD280基本在1.8～2.0之间，说明提取的DNA中RNA含量较少且没有蛋白质、酚污染;OD260/OD230均远远小于2，表明三种方法提取的DNA均有盐类、小分子污染，尤以异硫氰酸胍法污染严重。同时，采用异硫氰酸胍法提取的DNA的浓度远远大于CTAB法和SDS法。

2.2 基因组DNA的凝胶电泳检测

由图1可知，经过四次重复实验，用异硫氰酸胍法提取的麦芽糊精DNA谱带单一，无DNA碎片和连片，说明此方法提取的DNA完整性好;四次重复实验的DNA条带迁移率一致，且重现性好，说明此方法具有较好的稳定性。而在凝胶上看不到SDS法和CTAB法提取的基因组DNA谱带，其可能原因一是这两种方法提取的DNA浓度较低;二是没有提取到DNA，所以观察不到条带。

2.3 基因组DNA的PCR扩增反应

麦芽糊精基因组DNA的PCR反应结果见图2和图3。从二图中可以看出，三种提取方法得到麦芽糊精基因组DNA样品的PCR扩增片段大小与预期一致。说明三种方法提取的麦芽糊精基因组DNA可以直接用于18SrDNA基因和植物叶绿体rbcLDNA片段的PCR扩增。因此，可以认为这三种方法均可提取到麦芽糊精基因组DNA，且满足PCR扩增实验的要求。此结果也可以说明图1的电泳结果中SDS法和CTAB法未出现谱带的原因是DNA量太少，故EB染色后观察不到条带。

图1 麦芽糊精基因组DNA琼脂糖凝胶电泳

图2 18S rDNA片段的PCR产物

图3 RBCL片段的PCR产物

3 讨论

基因组DNA的提取质量是影响分子生物学研究结果的关键因素之一。麦芽糊精的原料是含淀粉质的玉米、大米等，因此适用于植物基因组DNA的提取方法也可用于麦芽糊精基因组DNA的提取，例如CTAB法、SDS法和异硫氰酸胍法等。从光密度、琼脂糖电泳和PCR的检测结果来看，实验采取异硫氰酸胍法所提取的麦芽糊精基因组DNA完整性好，浓度高，虽然小分子杂质含量高，但不影响PCR扩增实验;CTAB法和SDS法提取的麦芽糊精基因组DNA杂质含量较少，浓度虽然较低(甚至EB染色后看不到电泳的谱带)，但是PCR扩增实验后亦有清晰的目的谱带。结果说明，经过DNA含量测定和电泳检测比较，认为异硫氰酸胍法更适合麦芽糊精基因组DNA的提取;相对于PCR扩增实验，三种提取基因组DNA的方法均是可行的。这三种方法均具有操作步骤少、实验条件要求不高的特点。

本实验以市售麦芽糊精为材料，在操作过程中需注意以下几点:a.样品与抽提液要充分混匀，避免成团结块的现象出现;b.麦芽糊精与CTAB抽提液或SDS抽提液混合后应在65℃水浴中温育30～60min，并多次进行颠倒混匀，以完全破坏细胞膜，使DNA释放到液相环境中，从而增加DNA得率。

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Comparison of different extraction methods of genomic DNA from malt dextrin

XU Wei－li1，LI Qi－ming2，WANG Jia－qi2，MA Ying1，*

(1.School of Food Science and Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China;2.Technique Center，New Hope Dairy Holdings Co.，Ltd，Chengdu 610023，China)

To find out a better one from three malt dextrin DNA extraction methods for the molecular marker analysis of high quality and sufficient samples.With malt dextrin purchased from the market as the tested material，the genomic DNA was extracted from malt dextrin using three different methods，such as CTAB method，SDS method and GuSCN method.The extraction effects of different methods were compared.The results of optical density detection showed that extraction amount and purity with GuSCN method were better than SDS method and CTAB method.The results of agarose gel electrophoresis determination showed that genome DNA band extracted by SDS method was clear and stable and genome DNA extracted by SDS method and CTAB method were not banded.The genomic DNA extracted with these methods all could be used in PCR reaction.The results showed that DNA could be obtained with three of all methods from malt dextrin，but the GuSCN method was the best extraction method.

malt dextrin;DNA extraction

Q789

A

1002－0306(2011)09－0217－03

2010－05－28 *通讯联系人

徐伟丽(1977－)，女，博士，讲师，从事食品生物技术和食品安全领域的研究。

四川省应用基础研究(2009JY0101)。