乙醇溶液逐步溶解分级直链糊精

,, ,,*,

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.南昌市食品药品检验所,江西南昌 330038)

乙醇溶液逐步溶解分级直链糊精

李燕1,罗舜菁1,黄丽2,胡秀婷1,*,刘成梅1

(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌330047;2.南昌市食品药品检验所,江西南昌330038)

本文基于乙醇溶液对直链糊精的溶解规律,建立了乙醇溶液逐步溶解分级直链糊精的方法。以平均多分散性DMa为评价指标,研究了直链糊精与乙醇溶液固液比、pH以及盐(KCl)对直链糊精分级的影响。结果表明:当固液比为1∶100时,DMa最小,分级效果最佳;酸性、碱性及中性环境均适宜直链糊精分级,当pH为6.00时,分级效果最佳;而盐的存在不利于直链糊精分级。因此,乙醇溶液逐步溶解分级法操作简单,成本低,是一种有效分级获得分子量分布窄的直链糊精的方法。

直链糊精,乙醇溶液,逐步溶解,分级,多分散性

Abstract:The object of this work was to establish a method of linear dextrin fractionated by alcohol gradient dissolution on basis of the solubility of linear dextrin in alcohol solution. The effects of ratios of linear dextrin to alcohol solution,pH and salt(KCl)on linear dextrin fractionation were investigated using the average molecular-weight dispersity(DMa)as an evaluation index. The results showed that the DMaof fractions was lowest when the ratio of linear dextrin to alcohol solution was 1∶100. It confirmed that the fractionation under this condition was best. Besides,this method of fractionation was applicable in the acidic,neutral,and alkaline environments. The dextrin fractionation at pH6.00 was optimal. However,the existence of salt was not favorable for the fractionation of dextrin. These results suggested that gradient alcohol dissolution,which was simple and low-cost,was an efficient method for fractionating linear dextrin into fractions with different molar masses of low DM.

Keywords:linear dextrin;alcohol solution;gradient dissolution;fractionation;molecular-weight dispersity

直链糊精(linear dextrin)是由数个或数十个葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接而成,其分子量小,具有较好的水溶性。与直链淀粉结构相似,直链糊精具有螺旋空间结构,具有良好的包埋特性,可包埋不同的客体,对包埋的客体起到保护或缓释的效果[1]。此外,直链糊精可作为食品添加物应用于低脂低热量食品中,添加直链糊精的食品具有良好的流变性、稳定性和口感[2]。因此,直链糊精在食品、医药等领域具有广泛的应用。分子量大小及分布是影响直链糊精性质与功能的关键因素,而目前经不同方法制备得到的直链糊精均存在分子量分布广的问题[3-5],限制了与其相关的基础研究和应用。因此,将直链糊精分级获得分子量分布窄的直链糊精具有重要的意义。

目前,糊精的分级方法主要包括色谱法[6-8]、膜滤法[9]和醇逐步沉淀法[10-11]。色谱法和膜滤法均依赖于特殊的仪器设备、成本高,尚不适合大规模分级糊精。Bertoft等[12]利用醇沉淀法将糊精分成若干个不同的组分;Hu等[11]亦采用醇逐步沉淀法分级糊精,得到了分子量分布窄的糊精。然而,采用醇沉淀分级糊精时易出现“共沉”现象,降低了分级效果。Gelders等[13]发现低温更利于糊精沉淀分级,且沉淀析出的糊精需通过低温高速离心才能与溶液有效分离,这增加了该法的成本和操作难度。

糊精在乙醇溶液中的溶解性与分子量有关,分子量小的糊精优先溶解,而分子量较大的糊精需在较低浓度的乙醇溶液中才能溶解,依此原理,可采用不同梯度浓度的乙醇溶液逐步溶解分级直链糊精,该操作避免了醇沉淀分级易出现的“共沉”现象,且操作简单、成本低,适宜应用于工业大规模生产。目前,尚未有关于采用乙醇溶液逐步溶解法分级糊精的报道,因此,本文旨在建立有效分级直链糊精的新方法——乙醇溶液逐步溶解法,获得分子量分布窄的直链糊精。

图1 乙醇溶液逐步溶解分级直链糊精的流程图Fig.1 The procedure of linear dextrin fractionation by gradient alcohol dissolution

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

糯玉米淀粉 山东福洋生物科技有限公司;普鲁兰酶 酶活力400 U/g，诺维信(中国)生物技术有限公司;无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、氯化钾等试剂 分析纯，上海化学试剂公司;硝酸钠、叠氮钠 色谱纯，上海晶纯生化科技股份有限公司。

AR224CN电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司;HCJ-6D恒温磁力搅拌水浴锅 金坛市瑞华仪器有限公司;SHB-3型循环水多用真空泵 郑州杜甫仪器厂;SY-5000型旋转旋蒸仪 上海亚荣生化仪器厂;FE28 pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;1200 series高效液相色谱仪 安捷伦科技有限公司;BI-DNDC/GPC示差折射仪 美国布鲁克海文仪器公司;BI-MwA多角度激光光散射仪 美国布鲁克海文仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 直链糊精的制备 准确称取50.0 g糯玉米淀粉,用pH为5.5的0.01 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液将其配制成质量分数为2.0%的乳液,然后置于沸水浴中搅拌1 h至淀粉完全糊化。将淀粉糊冷却至55 ℃,添加普鲁兰酶100 U/g(以淀粉干基重),于55 ℃水浴中酶解24 h,使糯玉米淀粉完全脱支。脱支结束后,将糊液沸水浴灭酶10 min,然后在4500×g离心20 min,上清液旋蒸,最后经真空冷冻干燥得到直链糊精。

1.2.2 直链糊精溶解性测定 配制乙醇与水体积比分别为5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9和1∶10的乙醇溶液,按照直链糊精与乙醇溶液固液比(以下简称固液比)为1∶50的比例添加直链糊精,添加的直链糊精质量记为m,然后将直链糊精-乙醇溶液体系于烧杯中置于60 ℃水浴中搅拌,充分溶解,然后在8000×g下离心20 min,弃掉上清液,沉淀部分在40 ℃烘箱烘干,称重,质量记为m1,根据下式计算每一浓度乙醇溶液下直链糊精的溶解性。

式(1)

1.2.3 乙醇溶液逐步溶解分级直链糊精 乙醇溶液逐步溶解分级直链糊精的流程如图1所示。准确称取2 g直链糊精,加入100 mL的乙醇与水体积比为3∶1的乙醇溶液中,在60 ℃水浴中搅拌4 h,使之充分溶解,然后在8000×g下离心20 min,将上清液旋转蒸发除去乙醇和大部分的水,浓缩液收集,备用;向上述沉淀物添加100 mL乙醇与水体积比为2∶1的乙醇溶液,在60 ℃水浴中搅拌4 h,充分溶解,然后在8000×g下离心20 min,上清液旋转蒸发除去乙醇和大部分的水,浓缩液收集,备用;重复上述步骤至乙醇与水体积比1∶1、1∶2、1∶5。将上述得到的浓缩液在真空冷冻下干燥,得到直链糊精级分分别命名为F3:1、F2:1、F1:1、F1:2和F1:5。最后,将剩余沉淀部分干燥,命名为>F1:5。此外,未分级直链糊精命名为Unf。各级分质量占直链糊精质量的比率为得率；所有级分得率的总和为累计得率。

1.2.4 直链糊精分级的工艺条件

1.2.4.1 固液比对直链糊精分级的影响 配制乙醇与水体积比为4∶1的乙醇溶液,用0.1 mol/L HCl溶液或0.1 mol/L NaOH溶液调节体系pH至7.00,KCl浓度为0 mol/L,按照固液比分别为1∶100、1∶50和1∶25加入直链糊精,然后按照1.2.3方法对直链糊精进行分级,考察不同固液比对直链糊精分级的影响。

1.2.4.2 pH对直链糊精分级的影响 配制乙醇与水体积比为4∶1的乙醇溶液,采用0.1 mol/L HCl溶液或0.1 mol/L NaOH溶液调节体系pH至4.02、6.00、7.00、8.01和10.02,KCl浓度为0 mol/L,按照固液比为1∶50加入直链糊精,然后按照1.2.3方法对直链糊精进行分级,考察pH对直链糊精分级的影响。

1.2.4.3 盐对直链糊精分级的影响 配制含0.05、0.1、0.2 mol/L KCl的乙醇溶液(乙醇与水体积比为4∶1),调节pH为7.00,按照固液比为1∶50加入直链糊精,然后按照1.2.3方法对直链糊精进行分级,考察盐对直链糊精分级的影响。

1.2.5 分子量的测定 参照文献[14]的方法:配制流动相(含0.02% NaN3的0.1 mol/L NaNO3溶液),经0.45 μm微孔滤膜过滤,然后,超声脱气30 min;称取适量分级得到的直链糊精,样品经流动相充分溶解后,过0.45 μm微孔滤膜。测试条件:流速为0.5 mL/min,凝胶色谱柱为PL Aquagel-OH mixed,进样量为100 μL,柱温为35 ℃,MALLS的光源气体使用氦气和氖气,波长632.8 nm,流动相的折光指数为1.336,直链糊精在溶液中的折光指数增量(dn/dc)为0.146,然后采用HPSEC-MALLS-RI系统测定各级分的重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)、峰值分子量(Mp)和多分散性(DM)。

其中,DM代表了糊精分子量的分散程度,公式为DM=Mw/Mn,通常Mw>Mn,因此DM>1,DM越接近1,表明糊精分子量分布越窄,分子量越均一。由于将直链糊精分为质量分布不均的几个级分,为评估每组直链糊精分级的效果,建立了指标平均多分散性DMa,通过下式进行计算[15]。

式(2)

式中,DMa为每组中各级分的平均DM;DMi为每组中第i个级分的DM;Xi为每组中第i个级分的得率。

2 结果与分析

2.1 直链糊精在乙醇溶液中的溶解规律

Li[16]等在60 ℃下利用甲醇将木质素分为甲醇可溶与甲醇不溶两种分级产物,并研究各组分结构与热学性质。由于在常温下直链糊精的溶解度较低,因此,后续分级实验过程均在60 ℃下进行。直链糊精在不同浓度乙醇溶液中的溶解规律如图2所示。当乙醇与水体积比为5∶1和4∶1时,直链糊精溶解性无明显差别,然而随着乙醇浓度的降低,直链糊精的溶解性逐渐升高。当乙醇与水体积比为1∶2时,溶解性达到63.8%,随后增加缓慢且趋于稳定。本文选择乙醇与水体积比为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5的浓度对直链糊精进行分级。

图2 直链糊精在乙醇溶液中的溶解曲线Fig.2 Solubility curves of linear dextrin in different alcohol aqueous solutions

2.2 固液比对直链糊精分级的影响

图3 固液比对直链糊精分级的影响Fig.3 The influence of ratios of linear dextrin to alcohol solution on fractionation of linear dextrin注:柱状图表示得率,折线图表示累计得率,图5同。

当乙醇与水体积比为3∶1和2∶1时,得到的级分为淀粉酶解时添加的鲁兰酶酶液残留物质,且吸水性强、粘度大,因此,未对其称重及后续分析。由图3可知,不同固液比下得到的各级分质量分布迥异。当固液比1∶100时,F1:1、F1:2、F1:5以及>F1:5的得率分别为12.9%、13.0%、4.9%和29.9%;当固液比为1∶50时,各级分得率依次为12.3%、13.2%、7.4%和35.2%;当固液比为1∶25时,各级分得率分别为13.6%、12.1%、7.6%、45.7%。由图3可知,就得率而言,当固液比为1∶25时,总累计得率最大,即回收率最高。但过高的固液比会给该法分离过程带来困难,因此未对更高的固液比进行分析。

图4 固液比为1∶100糊精级分的HPSEC-MALLS-RIFig.4 HPSEC-MALLS-RI profiles of dextrin fractions obtained at the ratio of linear dextrin to alcohol solution at 1∶100注:实线表示MALLS图,虚线表示RI图,图7同。

采用高效体积排阻色谱(HPSEC)联合多角度激光检测器(MALLS)和示差检测器(RI)对各级分进行分析,未分级直链糊精与固液比为1∶100下分级的HPSEC-MALLS-RI如图4所示。固液比为1∶50和1∶25的HPSEC-MALLS-RI类似,因此未给出。所有样品详细分子量信息见表1。当固液比为1∶100时,级分F1:1、F1:2、F1:5和>F1:5的Mp分别为3.177E+03、3.572E+03、4.958E+03和6.756E+03。表明随着乙醇溶液浓度的降低,依次得到的直链糊精分子量逐渐增大。这是因为乙醇溶液对直链糊精的溶解性依赖于直链糊精分子量,分子量小的糊精先溶解,而分子量大的糊精需在浓度更低的乙醇溶液中才能溶解。此外,未分级直链糊精的DM为2.130,固液比为1∶100时,各级分的DM依次为1.090、1.015、1.011和1.018,均比未分级糊精的小,表明经分级后,直链糊精分子量分布变窄,分子量更均一。综合考虑得率与分子量多分散性,以指标DMa评估整体分级效果,根据公式(2)计算固液比为1∶100、1∶50以及1∶25的DMa分别为1.032、1.066和1.051。由此可见,当固液比为1∶100时,所得级分的DMa值最小,分级效果最佳。

2.3 pH对直链糊精分级的影响

陈俊芳等[17]发现在强碱条件下,板栗淀粉颗粒发生明显变化;Lee等[18]发现淀粉在酸或碱性条件下会发生部分降解,且直链淀粉比支链淀粉对溶液pH敏感性更强;此外,pH对淀粉的黏度、透光率等加工特性亦有不同影响[19]。研究表明,pH显著影响淀粉的结构及理化性质。直链糊精作为淀粉的衍生物,且与直链淀粉结构相似,推测pH可能影响直链糊精的分级过程。图5为不同pH下分级所得各糊精级分的质量分布。由图5可知,不同pH下获得的各级分质量分布不同。当体系pH分别为4.02、6.00、7.00、8.01和10.02时,直链糊精累计得率依次为67.9%、69.9%、68.1%、67.3%和76.6%。由此可见,当pH为10.02时,直链糊精回收率最高。

表1 不同固液比下各级分分子量与DMTable 1 Molecular weight and DM of fractions obtained by gradient alcohol dissolution at different ratios of linear dextrin to alcohol solution

图5 pH对直链糊精分级的影响Fig.5 The influence of pH on fractionation of linear dextrin

图6为pH6.00下各级分的HPSEC-MALLS,其它pH下得到各级分的图与之相似,未给出。各级分的详细分子量与DM见表2。由图6可知,级分F1:1、F1:2、F1:5以及>F1:5的主峰依次向前移动,即Mp呈现逐渐增大的趋势,与表2结果一致。表明随着乙醇溶液浓度的降低,得到的直链糊精分子量逐渐增大。此外,各级分的DM(见表2)均比未分级直链糊精的DM(2.130)低,表明乙醇溶液逐步溶解法在酸性、中性和碱性条件下均适用,并得到理想的分级效果。同理,根据公式(2)计算pH4.02、6.00、7.00、8.01、10.02下各组分的DMa分别为1.052、1.029、1.066、1.044、1.111。由此可见,综合考虑得率与DMa,当pH为6.00时,分级效果最佳。

表2 不同pH下各级分分子量与DMTable 2 Molecular weight and DM of fractions obtained by gradient alcohol dissolution at different pH

表3 不同KCl浓度下各级分分子量与DMTable 3 Molecular weight and DM of fractions obtained by gradient alcohol dissolution at different KCl concentrations

图6 pH6.00下各级分的HPSEC-MALLSFig.6 HPSEC-MALLS profiles of fractions obtained at pH6.00

2.4 盐对直链糊精分级的影响

研究表明,盐能显著影响淀粉的理化性质,包括糊化特性、流变学性质、透明度和溶解性等[20-24]。王冠青等[25]通过zeta电位分析仪探讨了盐离子与淀粉分子间的相互作用,结果表明,Na+吸附在淀粉分子周围,降低了淀粉体系的电位,二者相互吸引。因此,推测盐可能影响直链糊精的分级。当乙醇溶液体系中存在盐时,仅级分F3:1为酶液中残留物质,比无盐环境多了级分F2:1。由此可见,盐显著影响直链糊精的分级。图7为0.2 mol/L KCl下各级分的HPSEC-MALLS-RI,添加0.05 mol/L和0.1 mol/L KCl的HPSEC-MALLS-RI未给出。每个级分中KCl含量不同,未对每个级分进行称重。

图7 KCl浓度为0.2 mol/L时各级分HPSEC-MALLS-RIFig.7 HPSEC-MALLS-RI profiles of dextrin fractions obtained at 0.2 mol/L KCl

不同盐浓度下各级分的分子量与DM见表3。由表3可知,当KCl浓度为0.05 mol/L时,F2:1、F1:1、F1:2、F1:5以及>F1:5的Mp分别8.976E+02、1.653E+03、2.715E+03、3.112E+03和6.159E+03,分子量逐渐增大,表明体系中盐的存在并未改变直链糊精的溶解顺序。此外,当KCl浓度为0.05 mol/L时,级分F1:1、F1:2和F1:5的Mw均低于未添加KCl时相应级分的Mw,相应的激光信号强度亦显著降低,表明盐的存在不利于大分子量直链糊精的溶解,降低了糊精的回收率。当盐浓度达到0.2 mol/L时,级分F1:1、F1:2和F1:5的DM值偏高,表明分级效果下降。由此可见,盐的存在不利于直链糊精分级,且盐浓度越高,影响越显著。

3 结论

本文建立了乙醇溶液逐步溶解分级直链糊精的方法,并探讨了不同因素对分级过程的影响。结果表明,该方法是一种有效分级直链糊精得到分子量分布窄的糊精的方法。随着乙醇溶液浓度的降低,得到的直链糊精分子量逐渐增大。当固液比为1∶100时,分级效果最好;其次,该分级方法在中性、酸性和碱性环境下均适用,当pH为6.00时,分级效果最佳;而盐的存在不利于直链糊精分级,且浓度越高,影响越显著。因此,乙醇溶液逐步溶解分级法操作简单,成本低,是一种有效分级获得分子量分布窄的直链糊精的方法。

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Fractionationoflineardextrinbygradientalcoholdissolution

LIYan1,LUOShun-jing1,HUANGLi2,HUXiu-ting1,*,LIUCheng-mei1

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology of Nanchang University,Nanchang 330047,China;2.Nanchang Institute for Food and Drug Control,Nanchang 330038,China)

TS236.9

B

1002-0306(2017)18-0165-08

2017-03-13

李燕(1991-)，女，在读硕士研究生，研究方向：食品加工新技术原理及应用，E-mail:1146970047@qq.com。

*通讯作者:胡秀婷(1987-)，女，博士，讲师，研究方向：食品资源利用与开发，E-mail:xthu@ncu.edu.cn。

国家自然科学青年基金(31601425)。

10.13386/j.issn1002-0306.2017.18.032