响应面法优化二氧化氯杀灭蛋壳大肠杆菌工艺研究

罗红霞，任发政，郭慧媛，赵 磊，黄彦芳，汪长钢，王 建

(1.北京农业职业学院食品与生物工程系，北京 102442; 2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

响应面法优化二氧化氯杀灭蛋壳大肠杆菌工艺研究

罗红霞1，任发政2，郭慧媛2，赵 磊1，黄彦芳1，汪长钢1，王 建1

(1.北京农业职业学院食品与生物工程系，北京 102442; 2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

利用Design Expert软件，根据Box－Behnken设计(BBD)原理采用四因素三水平的响应面分析法，对二氧化氯杀灭鲜蛋蛋壳大肠杆菌的条件进行了研究，获得了二次多元回归模型。对模型进行手动优化，利用优化模型优化出十组杀菌工艺参数，并对工艺参数进行了验证。

二氧化氯，大肠杆菌，鸡蛋，响应面法，优化

响应面法(Response Surface Methodology，RSM)是利用合理的实验设计，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法，广泛应用于化学化工、生物工程、食品工业等方面。它与正交实验设计法相比，具有实验周期短、求得的回归方程精度高、能研究几种因素间交互作用等优点。本研究以鸡蛋壳大肠杆菌杀菌量为评价指标，在二氧化氯浓度、pH、灭菌温度和浸泡时间四个单因素预实验的基础上，利用响应面分析法优化二氧化氯杀灭蛋壳大肠杆菌的条件，为鲜蛋消毒剂的进一步开发和保洁蛋生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鸡蛋 同批新鲜柴鸡蛋，采自北京农业职业学院养鸡场;二氧化氯 食品级，山东兆冠化工集团公司;营养肉汤培养基、营养琼脂培养基 国药集团化学试剂有限公司;大肠杆菌8099 北京农业职业学院食品与生物工程系食品检测实验室保藏。

精确电子天平;XSP－BM15显微镜;MVS－1漩涡混合器;100级洁净工作台;DHP－9272型电热恒温培养箱;移液枪;灭菌枪头;手提式压力蒸汽消毒器; HZQ－C空气浴振荡器;pH213台式酸度离子计;菌落计数器;血球计数板;灭菌生理盐水;灭菌蒸馏水;烧杯;L形玻棒;放大镜等。

1.2 实验方法

1.2.1 鸡蛋处理 将鲜鸡蛋用自来水冲洗，除掉表面污物，沥干后用75%酒精擦洗蛋壳，置超净工作台内紫外照射1h，中间翻转一次，以达到蛋壳灭菌效果。

1.2.2 菌种制备和接菌 将大肠杆菌8099以无菌操作方式接入营养肉汤培养基，(37±1)℃振荡培养12h，制备菌悬液。利用显微镜直接计数，将菌悬液稀释至适当浓度(5×106cfu/mL以上)，然后分装密封于10mL离心管中，放入4℃冰箱，备用。用移液枪以无菌操作方式取1mL菌悬液，注入含有9mL灭菌去离子水的离心管中，用漩涡混合器混匀，做成1∶10的稀释液，如此反复，将菌悬液做多个梯度稀释。取恰当稀释度的菌液进行平板涂布，用移液枪取1mL注入营养琼脂平板中，每个稀释度平行涂三个板，以L形灭菌玻璃棒将菌悬液涂布于琼脂表面，避免涂到平板边缘，将平板正置直至培养基表面干燥，将平板翻转，(37±1)℃培养45～48h，进行菌落计数，计算菌悬液活菌数。

表3 各因素方差分析表

以无菌操作方式用移液枪吸取1mL菌悬液，点接在灭菌鸡蛋的蛋壳表面，在超净工作台内干燥30min，使菌体充分固定。

1.2.3 二氧化氯处理 将固定菌种的鸡蛋浸入一定条件的ClO2溶液中，处理一段时间后，沥干，用10mL灭菌蒸馏水将菌体洗下，制成菌悬液。将菌悬液以

1.2.2的方法做2～3个梯度的稀释，并涂平板计数，计算活菌数。

1.2.4 杀菌量表示 杀菌量用活菌数的对数降低值表示，即－lgN/N0。其中，N0为起始活菌数;N为处理后活菌数，二者单位皆为cfu/mL。

1.2.5 响应面法实验设计 在单因素预实验基础上，采用Design Expert7.0实验设计软件，利用响应面方法(RSM)中的Box－Behnken设计(BBD)，以溶液pH、ClO2浓度、灭菌温度、浸泡时间4个因素为自变量，分别以X1、X2、X3和X4表示，每个因素取3个水平，以－1、0、+1编码，以大肠杆菌杀菌量Y为响应值，进行实验设计，实验方案见表1。

表1 Box－Behnken设计因素水平表

2 结果与分析

2.1 蛋壳大肠杆菌杀菌量BBD设计实验结果及响应面优化分析

按照Box－Behnken设计原理(BBD)的实验方案进行四因素三水平实验，实验结果见表2。

表2 Box－Behnken设计实验结果

利用Design Expert7.0软件对所得数据进行回归分析，得到多元二次回归模型为∶

利用Design Expert7.0软件的Box－Behnken模块对方程进行手动优化，去掉部分不显著项，得到多元二次回归模型为∶

表4 优化杀菌参数的验证

对模型(2)进行方差分析，结果见表3。

由表3可知∶一次项X1、X2和X4影响极显著，X3影响显著，二次项的影响极显著，影响显著;交互项X1X4影响显著，X1X2影响不显著。模型F= 164.07，P＜0.0001，说明回归方程描述各因子与响应值之间的非线性方程关系是极显著的，即这种实验方法是可靠的。模型的复相关系数R2=0.9850，修正复相关系数R2Adj=0.9790，而预测复相关系数=0.9593，说明该模型能解释97.90%响应值的变化，模型具有较好的回归性;模型信噪比(Adeq Precision)为52.256，说明该模型具有足够的信号来响应该设计，因而该模型拟合度良好，实验误差小，模型是合适的，可以对二氧化氯杀灭蛋壳大肠杆菌进行分析和预测。在所选取的因素水平范围内，各因素对结果的影响排序为∶溶液pH＞浸泡时间＞ClO2浓度＞灭菌温度。

分别将另外两因素固定在0水平，对经手动优化后的回归方程中的X1X2和X1X4交互项作响应曲面分析，见图1、图2。

图1 溶液pH和二氧化氯浓度的交互影响

图2 溶液pH和浸泡时间的交互影响

从图1可以看出，在25℃、10min条件下，pH保持不变，随着二氧化氯浓度增加，杀菌量逐渐增加;二氧化氯浓度不变，溶液pH在4～6的范围内，杀菌力先增大后减小。

从图2可以看出，在二氧化氯浓度为50mg/L、温度25℃条件下，pH保持不变，随着浸泡时间增加，杀菌量逐渐增加，且增加速度先快后慢;浸泡时间不变，溶液pH在4～6的范围内，杀菌力先增大后减小。

从图1、图2两个曲面看出，二氧化氯浓度和溶液pH交互作用不显著;浸泡时间和溶液pH的交互作用较为显著。

2.2 二氧化氯杀菌条件的优化

经过课题的前期研究发现，鲜蛋蛋壳大肠杆菌带菌量指数一般不大于105cfu/g·mL，因此由回归模型(2)来预测杀灭大肠杆菌的最优条件。

利用统计软件Design Expert，优化出10组杀菌工艺参数，并根据参数进行实验，结果见表4，大肠杆菌的死亡数量级均大于5，平均相对误差为2.71%，证明响应面法优化二氧化氯杀灭蛋壳大肠杆菌的工艺是可行的。

3 结论

首次将响应面分析法(RSM)用于杀灭蛋壳大肠杆菌条件的优化，获得良好的结果。获得的优化回归模型为

经响应面曲面法(RSM)优化出的杀灭5个数量级大肠杆菌的优化条件见表4，经检验证明10组杀菌参数均能达到杀菌效果。

利用该模型可以预测二氧化氯对鸡蛋大肠杆菌的杀菌量。生产中，建议通过数学模型选择合理的二氧化氯溶液浓度和处理时间，以确保得到理想的杀菌效果，并避免二氧化氯溶液浓度过高和处理时间过长对鸡蛋品质产生影响。

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Optimum process of Escherichia coli of chlorine dioxide inactivation on eggshell by response surface methodology

LUO Hong－xia1，REN Fa－zheng2，GUO Hui－yuan2，ZHAO Lei1，HUANG Yan－fang1，WANG Chang－gang1，WANG Jian1
(1.Food Bioengineering Department，Beijing Vocational Agriucltural，Beijing 102442，China; 2.College of Food Science＆Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

By using Design Expert software，in accordance with theory of Box－Behnken design，the condition that Escherichia coli of eggshell of fresh eggs killed by chlorine dioxide as a response of four variables was researched.Then the fitted multivariate quadratic regress model was obtained.The model was optimized by manual operation.By utilizing optimization model，process parameters of ten groups were optimized.The process parameters were tested and verified.

chlorine dioxide;Escherichia coli;egg;response surface methodology;optimization

TS201.2

B

1002－0306(2011)11－0283－04

2010－08－23

罗红霞(1962－)，女，教授，博士，研究方向:畜产食品科学。

国家科技支撑计划子课题(2006BAD22B02);国家蛋品工程技术研究中心资助项目。