高压脉冲电场协同酶法提取牛骨蛋白的研究

韦汉昌，韦善清，何建华

(1.广西师范大学，广西桂林 541004; 2.南宁地区教育学院，广西南宁 530001;3.广西大学，广西南宁 530001)

高压脉冲电场协同酶法提取牛骨蛋白的研究

韦汉昌1，2，韦善清3，何建华2

(1.广西师范大学，广西桂林 541004; 2.南宁地区教育学院，广西南宁 530001;3.广西大学，广西南宁 530001)

以新鲜牛骨为原料，研究高压脉冲电场协同风味酶提取牛骨蛋白。实验结果表明，牛骨粉经高压脉冲电场处理再进行酶解，不仅能够提高骨蛋白溶出率，而且能缩短酶解时间。在电场强度30kV·cm－1、脉冲数25、料液比1∶8、酶用量4000U/g(骨粉质量)、酶解温度50℃、pH6.5等条件下，酶解30min，牛骨蛋白溶出率可达65.2%。

高压脉冲电场，酶解，牛骨，蛋白质，提取

牛骨中含有丰富的蛋白质，新鲜牛骨中蛋白质含量为11.5%，其中含有17种氨基酸，其中有8种人体所必需的氨基酸［1］。牛骨蛋白90%为胶原蛋白，其具有良好的物理性能和生物学特性，在化工、食品添加剂、美容化妆品、医学、生物材料以及农业等领域有着广泛的应用。目前提取动物蛋白的方法主要是酶解法，但该方法酶解时间长、提取率较低。高压脉冲电场(PEF)提取技术源于非热灭菌技术，是一种最有前途的、可实现工业化应用加工的技术。高压脉冲电场可在瞬间使被处理细胞的细胞壁和细胞膜电位混乱，改变其通透性，并可击破细胞壁和细胞膜，发生不可逆破坏，造成细胞新陈代谢紊乱、细胞中生长的必需组分流出，不仅能灭菌，而且有助于天然物质的提取［2－3］。近几年，高压脉冲电场提取技术应用于植物成分的提取研究中取得了一些进展［4］，但应用于动物骨蛋白的提取研究甚少。本文研究了高压脉冲电场协同酶解技术从牛骨中提取牛骨蛋白，为高压脉冲电场提取动物蛋白的研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜牛肋骨 市售;风味酶 南宁东恒华道生物科技有限责任公司，25万U/g;碳酸钠、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、硫酸铜、硫酸钾、硫酸、硼酸 西陇化工，AR。

IHV－30高压电场脉冲发生器 成都英特罗克科技有限公司;静态处理腔 电极间距可调，自制; PHS－3C pH计 上海雷磁;KDT－1000全自动定氮仪 苏州天威仪器有限公司;RE201C旋转蒸发器爱博特科技发展有限公司;FW－100高速万能粉碎机

天津泰斯特仪器有限公司;TD5A－WS离心机 湘仪离心机仪器有限公司;DZKW－4电子恒温水浴锅

南昌市恒顺化验设备制造有限公司;电动搅拌器。

1.2 实验方法

1.2.1 牛骨粉的制备 用切割机将新鲜牛肋骨切割成长度为3～5cm的骨块，清水洗净牛骨块，剔除非骨成分。牛骨块置于锅中，以蒸馏水刚好浸没为宜，微沸1h，除去残血，取出脱脂;高压蒸煮3～4h至牛骨软化并与肉、脂分离，即可出锅。用双层纱布过滤，滤液冷却至10℃除去脂肪后可用于制备骨汁粉。骨块65℃恒温干燥24h后进行粗粉碎、细粉碎，过160目筛。细粉碎时加入适量的环状糊精以消除制品的腥臊气味。

1.2.2 牛骨蛋白质提取 选用风味酶为水解酶。该酶水解动物蛋白质得到的水解液澄清、无苦味、盐含量低，进行Maillard反应后所得的蛋白质能保持原有风味，产品可用于制备风味食品添加剂。

考虑到高压脉冲电场对酶活性的影响［5－7］，本实验分两步进行。第一步是将牛骨粉按一定的料液比与水混合，浸泡6h，然后放入耐高压绝缘袋并置于处理腔进行高压脉冲电场预处理;第二步是控制一定的酶用量、温度、酸度、料液比及酶解时间进行酶解，酶解结束后高速离心分离残渣，将水解液温度升高到130～140℃，恒温1h进行Maillard反应。

1.2.3 牛骨蛋白溶出率计算方法 参照国标GB/T 5009.5－2003，采用凯氏定氮法测定牛骨粉中蛋白质的含量及提取液中蛋白质浓度。牛骨蛋白溶出率的计算公式如下。

牛骨蛋白溶出率(%)=提取液中蛋白质浓度(g/mL)×提取液体积(mL)/［骨粉质量(g)×骨粉中蛋白质含量］×100%

1.2.4 提取条件研究方法 根据厂家提供的技术数据，风味酶水解动物蛋白的适宜条件为温度50℃、pH6.5、酶用量4000U/g(骨粉)、酶解时间5～7h。本研究在温度、酸度及酶用量不变情况下考察脉冲电场强度、脉冲数、料液比及酶解时间等单因素对牛骨蛋白溶出率的影响，然后在单因素实验结果的基础上，按L9(34)正交表进行四因素三水平正交实验，并用正交实验助手V3.1软件对实验结果进行极差分析和方差分析，优化提取条件。

2 结果与讨论

2.1 牛骨粉中蛋白质含量测定结果

表1 牛骨粉中蛋白质含量测定结果

2.2 高压脉冲电场辅助风味酶提取牛骨蛋白单因素实验

在温度50℃、pH6.5、酶用量4000U/g(骨粉)等条件下，考察高压脉冲电场强度、脉冲数、料液比及酶解时间等对牛骨蛋白溶出率的影响。

2.2.1 电场强度的影响 图1为在脉冲数15、料液比1∶10及酶解时间30min等条件下脉冲电场强度对牛骨蛋白溶出率影响的实验结果。实验结果显示，电场强度低于10kV·cm－1时，对骨蛋白溶出率影响不大;电场强度超过15kV·cm－1时，蛋白质溶出率显著增大，此时细胞膜、细胞壁被击穿的孔数大幅增加，细胞内物质流出增加;超过30kV·cm－1后，溶出率增幅趋缓，此时的膜孔已经完全被不可逆击穿。尽管脉冲电场强度超过30kV·cm－1后，蛋白质溶出率仍有所增加，但是考虑到电场强度过大，容易使蛋白质发生变性［8－12］，脉冲电场强度不宜太高，应控制在30kV·cm－1以下。

图1 电场强度对骨蛋白溶出率的影响

2.2.2 脉冲数的影响 图2为脉冲电场强度25kV· cm－1、料液比1∶10及酶解时间30min等条件下，脉冲数对骨蛋白溶出率的影响。图2中显示脉冲数超过20次后，溶出率增幅变小。

图2 脉冲数对骨蛋白溶出率的影响

2.2.3 料液比的影响 料液比是影响蛋白质溶出率的主要因素之一，料液比增大有利于高压脉冲电场抽提骨蛋白，但料液比增大会使酶的浓度降低，不利于蛋白质降解。图3为在脉冲电场强度25kV·cm－1、脉冲数

15及酶解时间30min等条件下，料液比对骨蛋白溶出率的影响。实验结果显示，料液比适当增大时，有利于蛋白质溶出，料液比超过1∶8时，骨蛋白溶出率下降，因此料液比应控制在1∶8较为适宜。

图3 料液比对提取率的影响

2.2.4 酶解时间的影响 图4为在脉冲电场强度25kV·cm－1、脉冲数15、料液比1∶10等条件下，酶解时间对骨蛋白溶出率影响的实验结果。由图4可知，骨蛋白溶出率随酶解时间增加而增大，但超过30min后，骨蛋白溶出率增幅变小。

图4 酶解时间对骨蛋白溶出率的影响

2.3 高压脉冲电场辅助风味酶提取牛骨蛋白提取条件的优化

根据单因素实验结果，在50℃、pH=6.5及酶用量4000U/g(骨粉)等条件下，以电场强度、脉冲数、料液比及酶解时间作为考察因素，各取三个水平，以骨蛋白溶出率为考察指标，按L9(34)正交表进行实验设计，优化提取条件。水平取值、实验结果、极差分析结果及方差分析结果分别见表2、表3。

表2 正交实验结果及极差分析

表3 方差分析结果

极差分析结果与方差分析结果无明显差异，四因素影响显著性为A＞B＞C＞D，最佳提取工艺条件为A3B3C2D2，即电场强度30kV·cm－1，脉冲数25、料液比1∶8及酶解时间30min。此条件进行三次平行实验，牛骨蛋白溶出率的平均值为65.2%。

3 结论

表4为在酶解温度50℃、pH6.5、酶用量4000U/g (骨粉)、料液比1∶8等条件下，风味酶独立水解法与高压脉冲电场辅助风味酶水解法平行实验结果的比较。

表4 水解效果比较

从实验结果看，高压脉冲电场辅助法不仅能有效提高骨蛋白溶出率，而且也能大幅缩短酶解时间，酶解效率更高。

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Research on extracting protein from cattle bone by enzymolysis coupled with PEF

WEI Han－chang1，2，WEI Shan－qing3，HE Jian－hua2
(1.Guangxi Normal University，Guilin 541004，China; 2.Nanning Prefecture Education College，Nanning 530001，China; 3.Guangxi University，Nanning 530001，China)

The technology of extracting protein from cattle bone by flavor protease coupled with pulsed electric field (PEF)was researched.For extracting protein from cattle bone powder pre－treated by PEF，the results of experiments showed that it not only could make the enzymolysis time short but also increase the dissolution ratio of protein.Under the conditions of electric field intensity 30 kV·cm－1，pulse number 25 times，material to liquid ratio 1∶8(g/mL)，enzymes usage 4000U/g，enzymolysis temperature 50℃，pH=6.5 and enzymolysis time 30min，the dissolution ratio of bone protein could reach 65.2%.

PEF;enzymolysis;cattle bone;protein;extraction

TS251.94

A

1002－0306(2011)11－0280－03

2011－06－27

韦汉昌(1963－)，男，副教授，研究方向:天然物质的提取。

广西自然科学基金资助项目(桂科自0832105)。