α-葡萄糖苷酶的异源表达及纯化研究进展

吴孔阳，陈桂光，黄时海，张云开，于 岚，梁智群，*

(1.广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁 530004; 2.广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530005)

α-葡萄糖苷酶的异源表达及纯化研究进展

吴孔阳1，陈桂光2，黄时海2，张云开2，于 岚2，梁智群2，*

(1.广西大学轻工与食品工程学院，广西南宁 530004; 2.广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530005)

α－葡萄糖苷酶是工业生产低聚异麦芽糖的关键酶，应用领域较广，目前α－葡萄糖苷酶有大肠杆菌、酵母等表达系统，但酵母表达系统表达α－葡萄糖苷酶更具有显著的优势。层析是分离纯化α－葡萄糖苷酶的重要途径。概述了α－葡萄糖苷酶及其异源表达、分离纯化的最新研究进展，以便为该酶的深入研究和应用提供借鉴作用。

α－葡萄糖苷酶，低聚异麦芽糖，异源表达，纯化

α－葡萄糖苷酶(α－glucosidase，EC.3.2.l.20)，又名α－D－葡萄糖苷水解酶或α－葡萄糖基转移酶，广泛存在于许多植物、动物、微生物中。根据其底物特异性和蛋白质一级结构，将该酶分成α－葡萄糖苷酶Ⅰ、Ⅱ两个家族，也就是糖苷水解酶(GH)家族13和31，还可将该酶分成α－葡萄糖苷酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，这三种类型［1－2］。例如，α－葡萄糖苷酶家族Ⅰ中的成员，能够水解不同质底物如对硝基苯基－α－吡喃葡萄糖苷和蔗糖，且属于α－葡萄糖苷酶Ⅰ型，而α－葡萄糖苷酶家族Ⅱ中的成员则较易水解同质底物如可溶性淀粉、糖原和麦芽低聚糖等，且属于α－葡萄糖苷酶Ⅲ型［3－4］。大多数α－葡萄糖苷酶可以水解麦芽糖并发生转苷作用。例如，黑曲霉α－葡萄糖苷酶能从麦芽糖等分子中的非还原末端切开α－1，4糖苷键，释放出葡萄糖，并能将游离出的葡萄糖残基转移到另一个葡萄糖分子或麦芽糖等分子中的α－1，6位，形成异麦芽糖、潘糖等低聚异麦芽糖［5］。低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharides，IMOs)能使人体内的双歧杆菌得到显著增殖［6－7］，促进食物的消化吸收，调整肠道内的菌群，增加有益菌的比例，维持肠道正常功能等。将具有潜在价值的α－葡萄糖苷酶基因转入到其它适于工业化生产的工程菌中，实现低成本、高效率表达，用于转苷生产低聚异麦芽糖，具有重要的理论和应用价值［7］。

1 α－葡萄糖苷酶简述

α－葡萄糖苷酶属于键专一性酶，其相对分子质量一般在40000～145000之间［8，32］。α－葡萄糖苷酶等电点一般在pH 3.0～5.0之间，但最适pH可以超过7. 0［9］。研究人员对不同来源的α－葡萄糖苷酶的分子结构做了大量研究，但仅少数一级结构得以确认，对其活性中心和高级结构，催化基团等方面的研究仍未弄清楚。有些α－葡萄糖苷酶为糖蛋白或者部分糖基化，Takayanagi等［10］从黑曲霉α－葡萄糖苷酶中分离出7种低聚糖，主要含有甘露糖、N－乙酰葡萄糖胺和半乳糖等。此外，有相关文献［11－13］报道了关于α－葡萄糖苷酶的水解转苷机制及底物识别等方面的研究。

表1 国内外部分已克隆表达的α－葡萄糖苷酶基因

2 α－葡萄糖苷酶的异源表达概况

现已报道的α－葡萄糖苷酶异源表达的例子很多，α－葡萄糖苷酶基因的来源主要集中在嗜热菌属、曲霉属、大麦等(见表1)。表达所选用的宿主主要是大肠杆菌和毕赤酵母，此外也有研究人员选用酿酒酵母及其他丝状真菌。

2.1 α－葡萄糖苷酶的在原核生物中的表达

大肠杆菌是目前应用最广泛的基因表达工具，因其简单、廉价、高效的特性而成为蛋白质表达及功能研究的首选。Martino等［14］从硫化叶菌MT－4菌株(Sulfolobus solfataricusMT－4)中扩增其α－葡萄糖苷酶基因，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达，湿生物质的酶活可达到87.5U/g，且重组嗜热α－葡萄糖苷酶的性质与商品化黑曲霉α－葡萄糖苷酶相当。该重组酶可以在高温下作用更长时间，整个工艺过程能保证高的底物溶解性和生物反应器的无菌状态，因而使其在糖化工艺中更有竞争力。本课题组利用大肠杆菌工程菌 DHS－2，表达来源于黑曲霉(Aspergillus niger)M－1菌株的高转苷活性α－葡萄糖苷酶基因，并对DHS－2的发酵条件进行了优化，重组 α－葡萄糖苷酶活力由 178.53U/mL提高到618.75U/mL。质粒稳定性研究表明，DHS－2在传代100代以内，质粒的保留率为82%以上，表现出较好的稳定性，并且工程菌能够将高浓度麦芽糖(25%)有效地转化为低聚异麦芽糖［15－16］。Nakao等［17］曾将枯草芽孢杆菌α－葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中表达，重组酶有较宽的底物特异性和高的热稳定性，十分有利于转苷反应，进而达到连续生产低聚糖的目的。

Nashiru等［18］首次报道了一株嗜热菌α－葡萄糖苷酶基因的序列，并将该基因在大肠杆菌中表达，重组酶活力是天然酶的10倍。Wang等［19］将一株具有潜在工业应用价值的嗜热厌氧乙醇菌JW200的α－葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中表达，所获得的重组酶能够将高浓度麦芽糖溶液(40%)转化生成低聚糖，转化率达到52%，形成的低聚糖中有83%的组分为低聚异麦芽糖(异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖)。这与其他来源的α－葡萄糖苷酶所形成的转苷产物不同，比如酿酒酵母和黑曲霉α－葡萄糖苷酶的转苷产物主要是异麦芽糖、潘糖，而地芽孢杆菌α－葡萄糖苷酶转苷产物则是异麦芽糖。

此外，α－葡萄糖苷酶还可以在枯草芽孢杆菌系统中表达，Hung等［20］将一株分离自深海沉积物中的细菌Geobacillusα－葡萄糖苷酶基因在枯草芽孢杆菌中过量表达，并进行了定点突变实验研究，结果表明除了Asp199、Asp326、Glu256位氨基酸以外，Asp98也是保证酶活性所必须的氨基酸，重组酶和天然酶的分泌量都在2g/L左右，而且它们的酶学性质相似。

2.2 α－葡萄糖苷酶在真核生物中的表达

虽然原核表达技术已十分成熟，且能在较短的时间内获得基因表达产物，且所需的成本相对较低，但还存在许多难以克服的缺点，如目的蛋白常以包涵体形式表达，致使产物纯化困难;原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低等。这也使得一些α－葡萄糖苷酶基因需要其他系统才能实现高效表达，其中比较理想的是酵母表达系统。因其具有:a.营养要求简单、生长快、操作方便、易于培养和遗传操作［21］，b.对蛋白进行翻译后的加工修饰如糖基化、脂酰化、磷酸化以及蛋白裂解、折叠、二硫键的形成等［22］，c.发酵工艺成熟、易放大［23］，d.重组蛋白表达量高［24］，e.安全性高等优点［25］，已成为生产重组蛋白的重要工具。此外，在大肠杆菌中以包涵体形式出现的蛋白在酵母中表达时可生成可溶性的蛋白，易于分离纯化。

Hostinová等［26］将复膜孢酵母属的α－葡萄糖苷酶基因在酿酒酵母中进行了异源表达，重组酶主要集中在细胞表面，同样能够水解麦芽低聚糖，但是不能够水解可溶性淀粉，这与α－葡萄糖苷酶的底物特异性相一致。来源于黑曲霉、构巢曲霉的α－葡萄糖苷酶被证实具有很强的转苷活性［27］，尤其是对黑曲霉α－葡萄糖苷酶的异源表达研究成为热点，作为工业生产菌株黑曲霉GN－3(Aspergillus nigerGN－3)多次成为异源表达的基因来源，并取得一系列成果。Nakamura等［28］克隆得到黑曲霉GN－3菌株的α－葡萄糖苷酶基因，序列分析表明，该菌株α－葡萄糖苷酶基因含有3个内含子，cDNA序列全长2955bp，编码985个氨基酸，并将其导入构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中进行表达，酶活力达到0.4mU/mg。Lee等［29］通过构建新的重组质粒，将Aspergillus nigerGN－3的α－葡萄糖苷酶基因在Aspergillus niger中表达，转化子的酶活力达到240mU/mg，极大提高了酶活力，这对于工业生产极为有利，并将其应用到工业生产中。之后，Ogawa等［30］又将该菌株的α－葡萄糖苷酶基因在构巢曲霉中进行表达研究，尽管重组酶的分子量比出发菌株稍低一些，但是两者的最适pH和底物特异性依然相近。Tong和 Chen等采用Overlap－PCR方法扩增得到黑曲霉(NO.SG136) α－葡萄糖苷酶基因［31］和RT－PCR方法扩增得到黑曲霉(CICIM F0620)α－葡萄糖苷酶基因［32］，先后将这两种方法获得的基因在毕赤酵母中表达，结果表明，得到的重组α－葡萄糖苷酶活力相差近25倍(0.08U/mL VS 2.07U/mL)，并认为前者酶活低可能原因是由于所得的α－葡萄糖苷酶基因序列在酵母中的不识别和靶基因的低拷贝数所致。值得提出的是，黑曲霉(CICIM F0620)α－葡萄糖苷酶在酵母中表达的酶活力是迄今已报道的黑曲霉α－葡萄糖苷酶的最高水平。

此外，植物来源α－葡萄糖苷酶的异源表达主要集中在对大麦的研究上，同样也取得较大突破，α－葡萄糖苷酶在谷类作物种子萌发、淀粉降解过程中起到重要作用。最早是Tibbot等［33］将其在毕赤酵母中表达，该研究表明植物糖酶可以在毕赤酵母中进行异源表达，使得通过基因修饰来获取所期望的工业性状的重组酶成为可能。Muslin等［34］同样将大麦来源的α－葡萄糖苷酶在毕赤酵母中表达，通过40L发酵罐的放大实验，分泌蛋白的产量达到2g/L，比之前他们用摇瓶实验结果高出12倍多(2g/L VS 0.15g/L)，他们还首次报道了底物对任何α－葡萄糖苷酶都有抑制作用。

3 α－葡萄糖苷酶分离纯化的研究

3.1 表达检测的方法

α－葡萄糖苷酶可与许多底物作用，且方法简便灵敏度较高使得筛选工作很方便。目前筛选重组转化子和检测酶活大致有 3种方法:a.发色底物(pNPG)测定α－葡萄糖苷酶活力，采用对－硝基苯酚－α－D－吡喃葡萄糖苷(pNPG)(其为无色)作底物，经α－葡萄糖苷酶水解α－1，4－葡萄糖苷键后可以释放出对－硝基苯酚(pNP)(碱性条件下是黄色)，因此可以通过测定400～420nm之间的吸光度;b.Knight－Allen法:测定其催化甲基－α－D－吡喃葡萄糖苷分解产生的葡萄糖，依据辅助酶的不同，检测葡萄糖方法又可分为葡萄糖氧化酶法、葡萄糖脱氢酶法和己糖激酶法，以葡萄糖氧化酶法较为常用［35］;c.荧光法，利用4－甲基伞形吡喃葡萄糖苷［36］、9－羟基异吩噻唑［37］等具有强烈荧光的特点，将它们衍生为无荧光的底物，以此进行测定。

3.2 重组α－葡萄糖苷酶的纯化方法

在重组α－葡萄糖苷酶的分离纯化中，与其它层析方法相比，亲和层析的纯化能力更为强大，一步纯化就可以得到很高的纯度，可以使酶纯化很多倍，活性蛋白的回收率通常很高，而且可以纯化其它方法难以分离的蛋白质。由于构建的载体携带有亲和标签，这样就可以通过亲和层析纯化蛋白，比如6个组氨酸标签等。Naested等［38］构建的毕赤酵母工程菌，其重组的α－葡萄糖苷酶的N端、C端均带有组氨酸标签。研究发现，只有N端的多聚组氨酸标签可以较弱地与镍柱进行亲和层析，最后用咪唑将其洗脱下来。C端标签不能与之结合，可能是由于形成的融合蛋白将其包埋所致。

疏水层析色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱等方法也常用于重组α－葡萄糖苷酶的分离纯化，通常是几种分离方法同时使用，这样可以达到理想的分离效果［19，32，34］。

4 展望

低聚异麦芽糖生产的关键酶制剂是α－葡萄糖苷酶［39］。虽然α－葡萄糖苷酶用途广泛，但就是缺少大量廉价的酶源供应。目前国内生产低聚异麦芽糖用α－葡萄糖苷酶主要依赖于进口，多为日本天野酶制剂公司提供，该制品从黑曲霉(Aspergillus niger)发酵制取［31］。黑曲霉α－葡萄糖苷酶属胞内酶，胞外酶的含量很低。如用传统的破壁方法从菌体中提取该酶，不仅周期长，成本高，而且工艺比较复杂。从酶法转化工艺路线的长短、技术的可行性和经济性、今后的实际应用前景等方面考虑，构建α－葡萄糖苷酶基因高效低成本的表达系统、降低制酶费用、一步转化麦芽糖得到低聚异麦芽糖是一个可以期待的研究方向。事实上，目前解决酶源问题的一个重要方法就是通过α－葡萄糖苷酶的异源表达，实现大量廉价获得α－葡萄糖苷酶的目标。α－葡萄糖苷酶已通过大肠杆菌、酵母、丝状真菌等成熟表达系统进行了表达，虽然得到了一些高表达量的工程菌株，但是总体看来，表达量仍然需要进一步提高才能满足工业上的需要。从现有的报道来看，α－葡萄糖苷酶异源表达呈现出多源化途径，毋庸置疑，曲霉属的α－葡萄糖苷酶很多都具有很强的转苷活性［27］，相比之下，真核表达系统以其特有的优势，在表达该种来源的α－葡萄糖苷酶方面更具有吸引力。此外，随着新的纯化方法的出现，重组酶的分离纯化过程将会变得更加快捷。

本课题组采用的pSE380载体为胞内表达型，其表达产物可能会被大肠杆菌蛋白酶降解，从而导致表达水平下降，今后可以考虑选择具有更为高效的表达系统实现较高水平表达。若采用分泌型的质粒表达该α－葡萄糖苷酶基因可能会提高目的蛋白的表达量。随着进一步的研究，通过考虑多重因素来设计高效表达方案以及新的表达系统的出现，相信在不久的将来，α－葡萄糖苷酶的异源表达将会取得更多突破，将会在基因工程产品及工业应用的各个领域发挥更大的作用。

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Advancement in heterologous expression and purification of α－glucosidase

WU Kong－yang1，CHEN Gui－guang2，HUANG Shi－hai2，ZHANG Yun－kai2，YU Lan2，LIANG Zhi－qun2，*
(1.College of Light Industry and Food Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China; (2.College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China)

α－glucosidase was the key enzyme preparation to industrial production of Isomaltooligosaccharides，and its application field was extensive.The currently expression system used for the expression of α－glucosidase were E.coli yeast cells and other expression systems.The yeast expression system had more significant advantages. Chromatography was a important way for the isolation and purification of α－glucosidase.α－glucosidase and heterogenous expression，separation and purification of the latest research progress of the enzyme in prokaryotic expression systems and eukaryotic expression systems were summarized，which provided some reference for further investigations and application of this enzyme.

α－glucosidase;Isomaltooligosaccharides;heterologous expression;purification

TS201.2+5

A

1002－0306(2011)12－0547－05

2010－11－08 *通讯联系人

吴孔阳(1985－)，男，博士研究生，研究方向:糖类物质的生物利用与功能开发技术。

国家高技术研究发展计划“863计划”(2006AA10Z339);国家自然科学基金项目(20362001)。