六味地黄丸含药血清对HK-2细胞TGF-β/Smad信号通路的影响*

郝艳鹏, 张 悦△, 刘煜敏, 陆 敏, 王 飞, 陆海英

(上海中医药大学1科技实验中心，2护理学院，上海 201203)

六味地黄丸含药血清对HK-2细胞TGF-β/Smad信号通路的影响*

郝艳鹏1, 张 悦1△, 刘煜敏1, 陆 敏1, 王 飞1, 陆海英2

(上海中医药大学1科技实验中心，2护理学院，上海 201203)

目的观察六味地黄丸含药血清对HK-2细胞增殖及其Smad通路信号影响。方法MTT法检测大鼠5%、10%、20%空白血清与5%、10%、20%含药血清对HK-2细胞增殖的影响，并采用蛋白印迹法检测10%含药血清对HK-2细胞Smad通路信号分子蛋白表达的影响。结果六味地黄丸含药血清可以促进HK-2细胞增殖；在HK-2细胞中，TGF-β1可明显促进Smad2蛋白的磷酸化，而10%六味地黄丸含药血清具有明显的抑制效应。10%六味地黄丸含药血清亦可促进SnoN蛋白表达，明显高于对照组和空白大鼠血清组。结论六味地黄丸含药血清能够抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞Smad2蛋白的磷酸化，促进TGF-β/Smad通路的负性调控因子SnoN蛋白的表达。

六味地黄丸； 肾小管上皮细胞； 信号转导； 蛋白表达

转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是公认的促纤维化细胞因子之一。在病理条件下，TGF-β通过其受体介导的Smads信号转导通路调节靶基因的表达，从而促进纤维化的发生和发展。因此，限制和逆向调控TGF-β/Smad信号的转导是治疗肾纤维化的关键。有研究表明传统中医药可以通过调控TGF-β/Smad信号的转导而发挥防治肾纤维化的作用[1],而且,六味地黄丸可延缓肾组织的纤维化[6]。本研究进一步观察六味地黄丸含药血清对肾小管上皮细胞的TGF-β/Smad信号通路是否有逆向调控的作用？

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物 健康雄性Wistar大鼠(180 g±20 g)20只，清洁级，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,合格证号为SCK(沪)2008-0016，上海中医药大学医学实验动物中心按照SPF级饲养。

1.2药物 六味地黄丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司，批号8074423)，取六味地黄丸200丸(每8丸相当于生药材量3 g)加蒸馏水约100 mL，搅拌，使之完全溶解后，浓缩其药液至0.78 kg/L。

1.3主要试剂 DMEM/F12培养基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，0.25%胰酶(Gibco)，青/链霉素注射液(杭州吉诺生物医药技术有限公司)，BCA蛋白定量试剂盒(Pierce )，RIPA裂解液(北京普利莱基因技术有限公司)，MTT(Amresco)，rhTGF-β1(Peprotech Inc.)，DMSO(国药集团化学试剂有限公司)，小鼠单抗Smad2(Cell Signaling)，兔抗大鼠p-Smad2多克隆抗体(Cell Signaling)，SnoN抗体(Santa Cruz)，小鼠抗大鼠Smad7单克隆抗体(R&D)，小鼠单抗GAPDH(上海康成生物工程公司)。

1.4主要仪器 CO2培养箱(SHEL LAB)，低温冷冻离心机(Sigma)，超净工作台(上海迅博实业有限公司医疗设备厂)，倒置显微镜(Olympus)，电泳仪(Bio-Rad)，全自动酶标仪(Biotek)，25 cm2塑料培养瓶(Corning)，塑料培养板(Corning，6孔、12孔、96孔)，微孔滤膜(上海市新亚净化器件厂)。

2方法

2.1含药血清的制备 大鼠按体重随机分为空白对照组(10只)和给药组(10只)，给药组以生药浓度为0.78 kg/L六味地黄丸水溶液，按10 mL水溶液/kg BW灌胃，每天2次，空白组给予同体积生理盐水灌胃，连续给药3 d，第4 d头次给药1 h后腹主动脉取血，4 ℃冷置过夜后3 000 r/min 离心15 min 分离血清， 56 ℃水浴30 min 灭活补体，超滤灭菌，-20 ℃保存备用。

2.2HK-2细胞的培养 人近端肾小管上皮细胞株HK-2，以含10%胎牛血清的DMEM/DF12培养液，5% CO2、 37 ℃恒温条件下培养。

2.3MTT法检测不同浓度含药血清对HK-2细胞增殖的影响 取生长至80%的细胞，制成5×107cells/L的细胞悬液每孔200 μL转种入96孔板中，细胞贴壁生长至60%左右时，用无血清的DMEM/F12培养基同步化24 h，将细胞分为5%、10%、20%正常大鼠血清(NS)组、5%、10%、20%含药血清(MS)组以及空白对照组，每组设5个复孔，培养48 h后每孔加入20 μL 5 g/L MTT，37 ℃恒温培养4 h，吸出上清液，加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡器振荡10 min，用酶标仪测490 nm 波长处每孔的吸光度值。

2.4细胞蛋白的提取 取生长至80%的细胞，制成5×107cells/L的细胞悬液，每孔1 mL转种入12孔板中，细胞贴壁生长至60%左右时，用无血清的DMEM/F12培养基同步化24 h后分组刺激。分组如下：正常组(Ctrl)、10%正常大鼠血清组(NS)、10%含药血清组(MS)、TGF-β1组(T)、10%正常大鼠血清+ TGF-β1组(NS+T)、10%含药血清+TGF-β1组(MS+T)进行实验。正常组用无血清DMEM/F12培养基培养24 h，NS、MS组分别用10% 正常血清和含药血清培养24 h，含TGF-β1组以终浓度为5 μg/L TGF-β1刺激30 min后收获细胞，弃去培养基，用预冷D-Hanks液洗涤12孔板细胞3次，每孔加入100 μL预冷的RIPA裂解液，反复吹打各孔细胞10 min，收集全部液体入EP管中。4 ℃、12 000 r/min离心10 min，转移上清液至另一预冷的1.5 mL EP管中。取少量上清按照BCA蛋白定量试剂盒说明书的操作步骤进行定量，用上样缓冲液将所有蛋白调至等浓度，充分混合后于100 ℃煮沸变性10 min，冰浴10 min后上样20 μL。

2.5Western blotting法检测HK-2细胞TGF-β/Smad通路信号分子蛋白的表达 蛋白变性后在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳中以上层胶80 V、下层胶150 V分离，然后采用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉封闭1 h后，加入Ⅰ抗4 ℃ 摇床过夜，第2 d 回收Ⅰ抗，TTBS缓冲液洗3次，每次10 min，再加入相应辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，室温摇床孵育2 h，最后用ECL化学发光法在X线胶片上显影，并扫描结果条带，测定吸光度值(absorbance,A)。

中3统计学处理

结 果

1MTT法检测不同浓度含药血清对HK-2细胞增殖的影响

由表1可见，与空白对照组比较，5%六味地黄丸含药血清组，10%、20%正常血清和六味地黄丸含药血清组A值明显增加(P<0.05)；说明都能促进细胞增殖；相同浓度情况下，大鼠10%、20%正常血清和六味地黄丸含药血清组A值比较无显著差异(P>0.05)；而5%六味地黄丸含药血清A值明显高于5%正常大鼠血清组(P<0.05)。

表1MTT法测定的各组HK-2细胞A值

GroupAvalueNormalserumDrug-containingserumControl0.64±0.170.64±0.175%0.68±0.160.82±0.12*#10%0.76±0.12*0.83±0.15*20%0.88±0.19*0.83±0.14*

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsnormal serum.

2Westernblotting结果

2.1Smad2蛋白表达及其磷酸化水平 各组间Smad2蛋白表达未见明显差异，而TGF-β1刺激组Smad2蛋白磷酸化水平明显升高(P<0.05)；与TGF-β1刺激组比较，NS+T组Smad2蛋白磷酸化水平无明显改变，而MS+T组Smad2蛋白磷酸化水平明显降低(P<0.05)，见图1。

图1各组HK-2细胞中Smad2蛋白表达及其磷酸化水平的比较

2.2SnoN、Smad7蛋白的表达 MS组、MS+T组均可见SnoN蛋白表达明显增加(P<0.05)，正常大鼠血清组未见此作用；而各组间Smad7蛋白表达未见明显差异，见图2。

图2各组HK-2细胞中Smad7、SnoN蛋白表达的比较

讨 论

肾小管上皮细胞转分化(tubular epithelial to menchymal transdifferentiation，EMT) 是肾小管间质纤维化发生和发展的重要病理机制之一。EMT受多种细胞因子、生长因子和激素的调节，其中TGF-β是最重要的促纤维化因子,在病理条件下可触发和完成EMT的全过程。Smads信号转导是TGF-β1诱导EMT的关键通路。国外文献报道TGF-β1以剂量和时间依赖的方式诱导Smad2的磷酸化和向核内转位[2]。核转录共抑制因子SnoN是TGF-β/Smad信号通路中的重要负性调控因子，能够与活化的Smad2相互作用，有效阻断Smad依赖的启动子的核转录活性，起到阻断TGF-β1诱导的EMT的作用[3]。

六味地黄丸为滋阴补肾的经典名方，出于宋·钱乙《小儿药证直决》，钱氏从《金匮》肾气丸减桂、附脱胎而成，为后世补剂之主方。方中熟地滋阴补肾、生血生精为君药；泽泻渗泄湿浊；山萸肉温养肝肾；丹皮性寒清热兼能祛瘀活血；山药健脾益肾，茯苓淡渗脾湿、清气分之热。本方用熟地、山萸肉、山药三味补益肝脾肾，用泽泻、丹皮、茯苓以泄浊清热渗湿，此方历来认为“补中有泻，寓泻于补，为通补开合之剂”，有熟地之滋补肾水即有泽泻宜泄肾浊以济之；有萸肉之温涩吁经即有丹皮之清泻肝火以佐之；有山药之收摄脾经即有茯苓之淡渗脾湿以和之，故一直认为六味地黄丸为“三补三泻”之剂，滋阴补肾之主方。六味地黄丸在治疗肾脏疾病方面有较为广泛的应用。现代研究表明[4，5]，六味地黄汤可增强机体的抗氧化能力，加速自由基及其代谢产物的消除，减轻体内的脂质过氧化反应，促进蛋白质的合成，加强受损组织的修复。李万斌等[6]研究发现六味地黄丸能够减轻5/6 肾切除大鼠残肾组织纤维化程度，而升高MMP-2活性，进而减少胶原的沉积，可能是六味地黄丸治疗慢性肾脏病的机制之一。六味地黄胶囊和六味地黄汤加味治疗性给药，均能改善阿霉素肾病综合征病鼠氮质血症、低蛋白血症和高脂血症，增强其抗氧化能力，加速自由基及其代谢产物的消除，减轻体内的脂质过氧化反应，以及改善病鼠肾组织病理学改变等[7]。另外六味地黄丸还可以抑制大鼠衰老基因的表达，起到延缓衰老的作用[8]。

本实验中用TGF-β15 μg/L作用于HK-2细胞30 min，诱导了Smad通路的激活，p-Smad2蛋白的含量比正常对照组明显增加，而给予六味地黄丸含药血清孵育24 h后p-Smad2蛋白的含量比模型组明显降低，可见六味地黄丸含药血清能够明显抑制TGF-β1的作用；而且六味地黄丸含药血清能明显促进HK-2细胞SnoN的蛋白表达，核转录共抑制因子SnoN是TGF-β/Smad信号通路中的重要负性调控因子，它可通过与Smad蛋白相互作用，来抑制TGF-β1靶基因的活化，从而调控TGF-β1的生物效应。因此，我们结合体内实验结果[9]，认为六味地黄丸对肾小管保护作用的部分机理为抑制Smad通路的激活以及促进该通路负性调控因子SnoN蛋白的表达。

[1] 刘煜敏，张 悦，何立群，等. 抗纤灵方对单侧输尿管梗阻大鼠TGF-β1-Smad通路的影响[J].中国病理生理杂志，2008，24(12)：2423-2427.

[2] Lan HY. Tubular epithelial-myofibroblast transdiferentiation mechanisms in proximal tubule cells[J]. Curr Opin Nephml Hypertens, 2003,12(1):25-29.

[3] Yang JW, Dai CS, Liu YH. A novel mechanism by which hepatocyte growth factor blocks tubular epithelial to mesenchymal transition[J]. J Am Soc Nephrol,2005,16(1):68-78.

[4] 汤依群，何小健，黄 宝，等.六味地黄丸抗氧化作用研究[J].中药药理与临床，2001，17(5)：2-3.

[5] 许友慧，陈明达，王长江.六味地黄丸治疗肾脏疾病的实验研究进展[J].河北中医，2009，31(6)：946-948.

[6] 李万斌，何泽云．六味地黄丸延缓5/6肾切除大鼠肾组织纤维化研究[J].中国药师，2009，12(4)：411-413.

[7] 林洁茹，潘竞锵，肖柳英，等．六味地黄胶囊及六味地黄汤加味对阿霉素性大鼠肾病综合征作用的实验研究[J].中医研究，2005，18(3)：17-19.

[8] 余榕捷，蒲含林，周天鸿，等.利用基因芯片研究六味地黄丸对老年大鼠基因表达的影响[J].中国病理生理杂志，2004，20 (2):260-265.

[9] 郝艳鹏，张 悦，刘煜敏，等. 六味地黄丸对庆大霉素肾中毒大鼠肾核因子κB的影响[J]. 中药材，2010，33(1)：86-89.

Effectofdrug-containingserumofLiuweiDihuangpillsonTGF-β/SmadsignalingpathwayinHK-2cells

HAO Yan-peng1, ZHANG Yue1, LIU Yu-min1, LU Min1, WANG Fei1, LU Hai-ying2

(1ExperimentCenterforScienceandTechnology,2CollegeofNursing,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China.E-mail:yuezhang_shanghai@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the effect of the drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills on the TGF-β1/Smad signaling pathway in HK-2 cells.METHODSThe proliferation of HK-2 cell was detected by MTT method. Western blotting analysis was used to investigate the effect of the drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills on the protein expression of the molecules of Smad signal transduction pathway.RESULTSThe drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills promoted the proliferation of HK-2 cells. The level of Smad2 phosphorylation in HK-2 cells treated with 10% drug-containing serum of Liuwei Dihuang pills was significantly lower than that in the cells treated with TGF-β1. Furthermore, SnoN, a negative factor in Smad signaling pathway, was up-regulated in HK-2 cells treated with 10% drug-containing serum.CONCLUSIONDrug-containing serum of Liuwei Dihuang pills inhibits TGF-β1/Smad signaling pathway, including reducing Smad2 phosphorylation and promoting SnoN protein expression.

Liuwei Dihuang pills; Renal tubular epithelial cells; Signal transduction; Protein expression

R285

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.029

1000-4718(2011)01-0149-04

2010-07-16

2010-10-06

国家自然科学基金资助项目(No.30371834);上海市教育委员会重点学科建设项目(第5期,No.J50301);上海高校创新团队建设项目

△通讯作者 Tel:021-51322391; E-mail: yuezhang_shanghai@yahoo.com.cn