GSK-3β抑制剂对结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响*

刘坤平， 钟雪云， 罗 枫， 赵 彤

(1 南方医科大学南方医院病理科， 广东 广州 510515； 2 暨南大学医学院附属清远医院病理科， 广东 清远 511500；3 暨南大学医学院病理学教研室， 广东 广州 510632)

GSK-3β抑制剂对结肠癌SW480细胞增殖和凋亡的影响*

刘坤平1，2， 钟雪云3， 罗 枫2， 赵 彤1△

(1南方医科大学南方医院病理科， 广东 广州 510515；2暨南大学医学院附属清远医院病理科， 广东 清远 511500；3暨南大学医学院病理学教研室， 广东 广州 510632)

目的探讨糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)抑制剂(2’Z,3’E)-6-溴靛’-3’-肟(BIO)对结肠癌SW480细胞β-catenin 、Bcl-2蛋白表达及细胞周期、凋亡的影响。方法应用不同浓度BIO作用于结肠癌SW480细胞，采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡，Western blotting检测β-catenin 和Bcl-2蛋白表达，免疫细胞化学检测β-catenin 及cyclin D1的表达，HE染色观察细胞形态。结果与BIO处理前SW480细胞相比，BIO处理组SW480细胞β-catenin蛋白表达明显上调并出现部分细胞核移位，cyclin D1蛋白表达及S期和G2/M期细胞不同程度增多，Bcl-2蛋白表达有所下调，细胞凋亡率明显下降，并出现细胞形态改变。结论GSK-3β抑制剂BIO作用于结肠癌SW480细胞呈现促增殖及抑凋亡作用，其机制主要与β-catenin信号转导通路激活以及与Bcl-2调控通路的平衡有关，其中β-catenin上调可能是影响结肠癌SW480细胞转归的主要因素。

结直肠肿瘤； 糖原合酶激酶3β； β-catenin； Bcl-2； 细胞增殖； 细胞凋亡

糖原合成酶激酶-3β ( glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β )是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶, 参与细胞内糖代谢、细胞增殖、分化和凋亡等多种重要生理过程。研究表明，GSK-3β是细胞内Wnt/β-链接素(β-catenin)、核因子-κB (nuclear factor-κB，NF-κB)等众多信号转导通路的主要调控酶, 通过对下游核转录因子的影响参与细胞增殖与凋亡的调控，已成为肿瘤治疗所关注的药物靶点，但调节GSK-3β对肿瘤细胞增殖、凋亡影响的实验结果不一，GSK-3β对肿瘤细胞生长起促进还是抑制作用目前仍存有争议[1, 2]。为此，本实验应用GSK-3β抑制剂(2’Z,3’E)-6-溴靛’-3’-肟[(2’Z,3’E)-6-bromoindirubin-3’-oxime,BIO]作用于结肠癌SW480细胞，比较BIO作用前后结肠癌细胞β-catenin、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/ leukemia-2，Bcl-2)及细胞周期素D1(cyclin D1)蛋白表达变化与细胞周期及凋亡变化的关系，观测GSK-3β抑制剂对SW480细胞增殖、凋亡的影响，探讨调控机制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1细胞及主要试剂 人结肠癌细胞株SW480由南方医科大学病理系实验室提供。BIO及二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自Sigma。细胞培养基RPMI-1640购自Gibco。标准胎牛血清购自天津TBD生物技术发展中心，Western blotting检测所用鼠抗人β-catenin、Bcl-2抗体购自Santa Cruz，兔抗人α-tubulin抗体购自Bioworld。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠及羊抗兔IgG购自Proteintech Group。细胞裂解液及蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术研究所。增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)液购自Pierce。免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术公司。碘化乙啶(propidium iodide，PI)周期检测试剂盒及FITC Annexin V凋亡检测试剂盒均购自BD Pharmingen。

1.2主要仪器 CO2培养箱购于Shellab，低温高速离心机购于Eppendorf，超净工作台购于苏州净化设备厂，全波长多功能酶标仪购于Tecan，普通光学显微镜购于Leica，FACS Aria流式细胞仪由BD Bioscience生产。

2方法

2.1流式细胞仪检测细胞周期 对数生长期细胞经0.25%的胰酶消化后，以2×108cells/L的密度接种于6孔板中，2 d后加入由DMSO溶解的不同浓度的BIO(0、1、2、4 μmol/L)，继续培养24 h，收集各组细胞，PBS离心重悬2次，70%预冷乙醇4 ℃固定30 min，PBS洗1次，加入含PI的染色液(按说明书操作)，避光孵育15 min经尼龙膜滤过后，上流式细胞仪检测。实验重复3次。

2.2流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞加入不同浓度BIO(0、1、2、4 μmol/L)培养24 h，经0.25%不含EDTA的胰酶消化，收集各组细胞，PBS离心重悬1次，用Annexin V-FITC/PI双染法上流式细胞仪检测细胞凋亡，具体操作严格按试剂盒说明书进行，凋亡细胞为Annexin V高染(Annexin V+)。实验重复3次。

2.3Western blotting检测β-catenin和Bcl-2蛋白表达 细胞加入不同浓度BIO(0、1、2、4 μmol/L)培养24 h ，按蛋白提取试剂盒操作步骤提取细胞总蛋白并测定蛋白浓度，每泳道加20 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳，湿转将蛋白转移至NC膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加鼠抗β-catenin(1∶100)、鼠抗Bcl-2 (1∶200)、内参照兔抗α-tubulin(1∶1 000)抗体，4 ℃摇床孵育过夜，TBS-T洗膜10 min×3次，加入相应辣根过氧化物酶标记羊抗鼠及羊抗兔IgG(1∶4 000)室温摇床孵育1 h，TBS-T洗膜10 min×3次后，ECL化学发光系统显色。扫描胶片，Quantity One软件分析灰度值，计算相对蛋白含量。实验重复3次。

2.4细胞块制备及HE染色、免疫细胞化学染色 细胞加入BIO(4 μmol/L)，对照组(0 μmol/L)加入等量DMSO，培养24 h 后收集细胞，离心弃上清，加入0.1%蛋清液混合，离心弃上清加入10%甲醛固定24 h后用滤纸包裹放入脱水盒按常规石蜡包埋制备蜡块，4 μm连续切片，一张做HE染色，其余备做免疫细胞化学。应用免疫细胞化学SP法染色，Ⅰ抗β-catenin及cyclin D1均为鼠单克隆抗体，购于北京中杉金桥生物技术有限公司。用已知大肠癌阳性组织切片作阳性对照，PBS 代替各Ⅰ抗作阴性对照，DAB 显色，苏木素复染。Cyclin D1以细胞核出现棕黄色细颗粒为阳性，200倍镜下随机选择5个视野，至少计数1 000个细胞，计算阳性表达率，细胞阳性表达率(%)=阳性细胞数/总细胞数×100%。

3统计学处理

结 果

1不同浓度BIO对SW480细胞周期的影响

不同浓度BIO(0、1、2、4 μmol/L)作用24 h后，应用流式细胞仪检测细胞周期结果显示，与对照组(BIO 0 μmol/L)细胞比较，BIO处理组G0/G1期细胞不同程度减少，S期和G2/M期细胞不同程度增多，见表1。

表1不同浓度BIO对SW480细胞周期分布的影响

ConcentrationofBIO(μmol/L)Cellcycledistribution(%)G0/G1SG2/M044.70±4.1643.33±1.3811.97±4.13136.70±2.99*52.90±7.4010.40±4.34235.93±2.0452.03±1.65*12.04±1.67441.13±3.5245.77±2.0313.10±3.26

*P<0.05vs0 μmol/L.

2不同浓度BIO对SW480细胞凋亡的影响

Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测SW480细胞凋亡结果显示，随着BIO浓度增加(0、1、2、4 μmol/L)，SW480细胞凋亡率(Annexin V+)逐渐降低，见图1，各组细胞凋亡率分别为(4.40±0.36)%、(2.67±0.47)%、(2.07±1.00)%、(1.47±0.49)%。

3不同浓度BIO对SW480细胞β-catenin、Bcl-2蛋白表达的影响

Western blotting结果显示不同浓度BIO处理SW480细胞后，细胞中β-catenin蛋白表达量逐渐增加，Bcl-2蛋白表达有所下调，见图2。

图1流式细胞术分析不同浓度BIO对SW480细胞凋亡的影响

图2Westernblotting检测不同浓度BIO作用SW480细胞β-catenin、Bcl-2蛋白表达

4BIO对SW480细胞形态、β-catenin核移位及cyclinD1表达的影响

HE染色结果显示，相比BIO处理前(图3A1)，BIO处理组(图3B1)细胞大小形态不一、瘤巨细胞数量增多、细胞核染色质增粗、核仁明显、核分裂数增多。免疫细胞化学结果显示，BIO处理前(图3A2)β-catenin蛋白表达主要定位于细胞膜、细胞质，BIO处理组(图3B2)β-catenin蛋白在细胞膜、细胞质表达明显增强并可见部分细胞核强表达；cyclin D1蛋白表达定位于细胞核，BIO处理组(图3B3)阳性表达率(7.15%)较对照组(图3A3) (6.86%)高，但未见显著差异(P>0.05)。

Figure 3. The morphological features (HE staining，×400) and β-catenin and cyclin D1 expression (immunohistochemical staining，×400)in SW480 cells before and after exposure to BIO.A1-A3: the morphological features and β-catenin and cyclin D1 expression in SW480 cells 24 h after DMSO exposure; B1-B3: the morphological features and β-catenin and cyclin D1 expression in SW480 cells 24 h after BIO(4 μmol/L, diluent DMSO)exposure.

图3BIO作用前后SW480细胞形态及β-catenin、cyclinD1蛋白表达

讨 论

结直肠癌是我国常见恶性肿瘤并呈上升趋势[3]，但治疗效果并未因多年的努力而得到明显改善，寻找新的肿瘤治疗靶点已是近年关注的热点。GSK-3β作为细胞内众多信号转导通路的主要调控酶，已在不同的肿瘤细胞株如结肠癌、肺癌、乳腺癌中发现调节GSK-3β活性可影响肿瘤细胞的生长及凋亡[4-7]，但抑制GSK-3β活性对肿瘤细胞生长影响的实验结果不一，Gould等[4]在实验性鼠肠肿瘤及Farago等[5]在乳腺上皮抑制GSK-3β的活性不同程度呈现促肿瘤生长作用，Li等[6]在人肺腺癌细胞通过抑制GSK-3β活性细胞凋亡受抑制，S期细胞数量增多，而Shakoori等[7]则观察到通过化学抑制剂及RNA干扰抑制结肠癌细胞GSK-3β活性，减弱了癌细胞的生长、诱导了细胞凋亡，出现了不同的实验结果，提示抑制GSK-3β活性对肿瘤细胞增殖、凋亡的影响及其机制尚不明确。 本实验显示不同浓度的GSK-3β抑制剂BIO作用于结肠癌SW480细胞后，细胞凋亡率随着BIO浓度增加由4.40%减少到1.47%，S、M期细胞数量和cyclin D1表达不同程度增多并出现细胞核染色质增粗、核仁明显、核分裂数增多等高增殖状态的细胞形态学变化，提示本细胞模型下抑制GSK-3β活性对肿瘤生长起促进作用。

GSK-3β抑制剂BIO是一种小分子ATP竞争性抑制剂，通过与ATP竞争以及影响GSK-3β调节因子磷酸化进一步抑制GSK-3β的活性[1, 8]。目前的研究显示GSK-3β抑制剂对肿瘤细胞产生不同的影响，其原因可能与GSK-3β下游信号转导通路在不同细胞株作用机制不同有关， 已有文献报道不同癌细胞NF-κB与β-catenin/TCF信号转导通路作用机制不同[9]，推测GSK-3β作为信号转导通路主要调控酶在不同的细胞可能产生不同的影响。

β-catenin信号转导通路在肿瘤的发生发展过程中起着至关重要的作用[10-12]，高表达β-catenin可通过TCF4等下游核转录因子促进细胞增殖与凋亡抑制。GSK-3β作为细胞内Wnt/β-catenin信号转导通路重要调控酶，滕颖等[13]在体外实验用不同浓度的GSK-3β抑制剂LiCl作用肺癌细胞导致β-catenin表达增加并出现核移位,同时增殖能力与克隆形成能力增强 ，本实验应用不同浓度的GSK-3β抑制剂BIO明显上调了SW480细胞β-catenin蛋白含量并出现部分细胞β-catenin核移位，与滕颖等应用LiCl对β-catenin的影响结果一致，提示不同种类的GSK-3β抑制剂均可上调β-catenin并影响细胞的增殖及凋亡。Cyclin D1 是Wnt/β-catenin通路重要靶基因之一[10]，其启动区被β-catenin/TCF激活并转录，本实验GSK-3β抑制剂BIO作用后cyclin D1阳性表达仅轻度增高，与β-catenin上调幅度不同步，此现象提示cyclin D1表达不仅受Wnt/β-catenin通路的调控，而且还受GSK-3β调控的其它下游通路的影响，Ougolkov等[14]在实验中观察到GSK-3β抑制剂降低胰腺癌细胞cyclin D1蛋白表达与NF-κB活性改变有关。

Bcl-2是NF-κB下游因子，作为凋亡抑制因子在细胞凋亡调控机制中起重要作用，实验表明GSK-3β作为细胞内信号转导通路重要调控酶影响Bcl-2的表达，Ougolkov等[14，15]及Bilim等[16]分别在胰腺癌、慢性淋巴细胞白血病及肾癌细胞发现小分子GSK-3β抑制剂或RNA干扰抑制GSK-3β活性对肿瘤细胞有抑增殖或促凋亡作用，其机制可能与Bcl-2 表达下调有关。Thotala等[17]在GSK-3β抑制剂对正常肠黏膜防辐射作用的实验中检测到GSK-3β抑制剂导致肠黏膜组织Bcl-2表达上调及凋亡受抑，本实验发现随GSK-3β抑制剂剂量增大，结肠癌SW480细胞Bcl-2的含量呈下降趋势，提示GSK-3β抑制剂对肠癌细胞、正常肠黏膜细胞Bcl-2表达的影响不同。本实验GSK-3β抑制剂BIO作用于结肠癌SW480细胞虽然出现凋亡抑制因子Bcl-2表达下调，但仍然呈现凋亡抑制的现象，提示此细胞模型下Bcl-2对凋亡的调控未占主导作用，其凋亡受抑有更有效的途径调控。

本实验结果显示β-catenin与Bcl-2参与了GSK-3β抑制剂BIO对结肠癌SW480细胞的促肿瘤生长作用，其机制与β-catenin信号转导通路激活以及与Bcl-2调控通路的平衡有关，其中β-catenin上调起到关键作用，提示GSK-3β抑制剂对肿瘤细胞生长的影响取决于促进和抑制通路的激活、平衡与自我稳定，在不同的细胞可能出现不同的转归。此外，GSK-3β抑制剂BIO明显上调结肠癌SW480细胞β-catenin表达、降低凋亡水平的现象，提示在众多结直肠癌实体肿瘤组织出现的β-catenin高表达状态[10,18]可能与肿瘤细胞凋亡抑制密切相关，并且可能是结直肠癌肿瘤组织多药耐药的原因之一。

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EffectsofGSK-3βinhibitoronproliferationandapoptosisofSW480cells

LIU Kun-ping1,2, ZHONG Xue-yun3, LUO Feng2, ZHAO Tong1

(1DepartmentofPathology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;2DepartmentofPathology,QingyuanHospital,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Qingyuan511500,China;3DepartmentofPathology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tongzhao@fimmu.com)

AIM: To investigate the mechanism and the effect of glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) inhibitor (2’Z,3’E)-6-bromoindirubin-3’-oxime (BIO) on the protein expression of β-catenin and Bcl-2, and proliferation and apoptosis in colon carcinoma SW480 cells.METHODSThe immunohistochemical staining and Western blotting were performed to detect the protein expression of β-catenin, cyclin D1 and Bcl-2. The cell cycle distribution and apoptotic rate were detected by flow cytometry. The morphologic features of SW480 cells before and 24 h after BIO exposure at different concentrations were observed under microscope with HE staining.RESULTSCompared with the untreated SW480 cells, the protein expression of β-catenin significantly increased and some β-catenin positive nuclear staining positive cells appeared in BIO treated cells. and The cells exposed to BIO showed that the cyclin D1 protein and the cells in S stage and G2/M stage moderately increased, the protein level of Bcl-2 moderately decreased, and the cell apoptosis rate was significantly lower than those in control cells. Furthermore, the morphological changes of the SW480 cells were observed 24 h after BIO treatment.CONCLUSIONOur results indicate that GSK-3β inhibitor BIO participates in the cellular processes of promoting proliferation and inhibiting apoptosis in colon carcinoma cells. The mechanisms are mainly associated with activating the β-catenin pathway and regulating the balance of Bcl-2 pathway, and the up-regulation of β-catenin is most likely the possible factor for SW480 cell regression.

Colorectal neoplasms; Glycogen synthase kimase 3β; β-catenin; Bcl-2; Cell proliferation; Apoptosis

R735.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.019

1000-4718(2011)01-0097-05

2010-06-10

2010-11-10

广东省科技计划资助项目(No.2009B080800023)

△通讯作者 Tel: 020-61648228； E-mail: tongzhao@fimmu.com