老龄大鼠心房肌细胞起搏电流的特征*

林 琨， 蓝云锋， 方 舟, 高进辽, 王红娟, 李 泱△

(解放军总医院1心血管内科，2老年心血管病研究所，北京 100853)

老龄大鼠心房肌细胞起搏电流的特征*

林 琨1， 蓝云锋2， 方 舟2, 高进辽2, 王红娟2, 李 泱2△

(解放军总医院1心血管内科，2老年心血管病研究所，北京 100853)

目的研究老龄大鼠心房肌细胞起搏电流(If)的特征，探讨其可能参与心房颤动的机制。方法选择22-24月龄SD大鼠分离心房肌细胞，利用全细胞膜片钳技术记录If。结果约85%的老龄大鼠心房肌细胞可以记录到的超极化激活If，在-150 mV时，If的电流幅值约为(382±23)pA，电流密度约为(3.2±0.4)pA/pF。而青年大鼠只有40%的心房肌细胞记录到If的电流幅值约为(86.9±8.4)pA，电流密度约为(0.9±0.1)pA/pF。从I-V曲线可见，老龄大鼠随着超极化电位的增加，电流增加幅度明显加快。在-150 mV时，其激活时间常数(τ)为(230.2±14.4)ms，而青年对照组心房肌细胞的τ则为(670.5±23.6)ms。此外，老龄大鼠心房肌细胞电流的半激活电压为(-87.2±2.3)mV，明显向更正的电位方向移动，而青年鼠细胞的半激活电压为(-104.4±6.3)mV，这使得老龄鼠的起搏电流更易激活。相反，二者的翻转电位和激活曲线斜率差异不大。结论老龄大鼠心房肌细胞起搏电流的密度和激活均高于青年鼠。

老龄大鼠； 心房肌细胞； 起搏电流

老年人心脏由于物质的改变或结构的老化，致使许多功能发生改变。其中电生理改变则是老化心脏表现的主要特征之一。在老年患者中，由于异位节律诱发的心房颤动占有很大的比例[1-3]。而异位节律的产生又与起搏电流((pacemaker current，If)有着密切的关系。If电流是一种去极化的钠、钾混合非特异电流,主要参与心脏起搏细胞4期自动除极。If活动增加,心肌组织自律性增加,容易导致快速心律失常[4]。目前发现心脏非起搏细胞同样存在此电流。是否此电流同样在房颤的发生中有作用值得探讨。且老年心房肌细胞起搏电流的特征如何也鲜有报道。因此，本文利用膜片钳技术研究了老龄大鼠心房肌细胞起搏电流及其特点,为老年人房性心律失常的机制研究提供理论和实验依据。

材 料 和 方 法

1试剂与溶液

胶原酶I 、蛋白酶E、牛血清白蛋白、MgATP、HEPES、CaCl2、BaCl2、CsCl、CdCl2、异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)、4-AP均为Sigma产品；EGTA购自Fluka Biochemika ；其它试剂均为分析纯。

1.1台氏液成分(mmol/L) NaCl 135, KCl 5.4, CaCl21.8, MgCl21, NaH2PO40.33, HEPES 10, 葡萄糖10,用NaOH调pH至 7.4；无Ca2+台氏液和0.2 mmol/L Ca2+的台氏液分别为台氏液中不加CaCl2或仅加 0.2 mmol/L CaCl2。

1.2细胞外液(mmol/L) NaCl 115, KCl 25, CaCl22, glucose 10, MgCl21, HEPES 10; 用NaOH调pH至7.4。BaCl22 mmol/L、CdCl2200 μmol/L和4-AP 4 mmol/L阻断IK1、ICa,L和Ito电流。

1.3电极内液 (mmol/L) K-glutamate 130, KCl 15, NaCl 5, MgCl21, HEPES 10, MgATP 5; 用NaOH调pH至7.4。

1.4细胞保护液(KB液，mmol/L) KCl 20.0，KH2PO410.0，葡萄糖10.0，谷氨酸70.0，牛磺酸10.0，EGTA 10.0，牛血清白蛋白(Amerco)10 g/L,用KOH调pH至7.4。

2大鼠心房肌细胞分离

方法参照文献并有所改进[5]，健康老龄大鼠(22-24月龄)，体重(650±55)g。击昏后迅速开胸取出心脏，置于温浴(37 ℃ 左右)的台氏液中，修剪后挂于灌流装置上，置于Langendorff 装置上行主动脉逆向恒流灌流。灌流步骤：(1)无钙台氏液灌注至心脏充分停跳，以解除心肌细胞间的桥粒和连接，使心肌松弛，约5 min。(2)胶原酶Ⅱ(0.36 g/L)和胰蛋白酶(0.1 g/L)液消化5-7 min左右；(3)剪下左右两个心耳，剪下心房部分置于 37 ℃ 液中剪碎，加新鲜消化液消化10 min，经150 μm尼龙网过滤，离心后重新置于新鲜KB液中室温保存。灌流系统保持37 ℃,所有液体均用100% O2饱和。分离出棒状、横纹清晰、细胞膜完整的单个心房肌细胞。

3膜片钳全细胞记录

采用全细胞膜片钳记录方法，膜片钳放大器(AXON-700B)与计算机连接。刺激信号及电压输入信号的采集均由软件(pCLAMP 9.02)控制。玻璃毛坯(GG-17)经微电极拉制仪(Narishige，pp-830)拉制成电阻为2.5-3.5 MΩ的电极。调节三维操纵器进行封接，使封接电阻达1 GΩ以上，吸破细胞膜形成全细胞记录模式。为消除细胞间误差，电流值以电流密度(pA/pF)表示。信号经截止频率为1 kHz的四阶贝塞尔低通滤波器，采样率为5 kHz。

4诱发If电流刺激参数的设定

4.1If电流的记录 保持电位-40 mV，施予4 000 ms，-150 mV的去极化脉冲，可引出超极化激活的内向电流。

4.2If电流I-V曲线 保持电位-40 mV，施予4 000 ms，阶跃10 mV，-150～-50 mV系列脉冲刺激，将各电压下的电流和尾电流密度对相应刺激电位作图。

4.3If电流稳态激活过程 按I-V曲线刺激模式，获得各电压下电流，换算为电导，以各去极化电位下电导与最大电导的相对值对脉冲电压作图，得If的激活曲线。依Bolzmann方程I/Imax=1/{1+exp[-(Vm-V1/2) /k]}求出半稳态激活电压(V1/2)和稳态激活曲线斜率(k)。

4.4If电流的翻转电位 保持电位-40 mV，施予2 000 ms，-150 mV的去极化脉冲，紧接着给予-100 mV至+40 mV的系列刺激，记录电流的改变，观察电流的翻转电位。

5统计学处理

结 果

1老龄大鼠心房肌细胞If电流密度的特征

约85%(17/20个细胞)的老龄大鼠心房肌细胞可记录到超极化激活If，在-150 mV时，If的电流幅值约为(392±23)pA，其电流密度约为(3.2±0.4)pA/pF[其电容约为(122.0±8.3)pF]。而青年大鼠只有40%(8/20个细胞)的心房肌细胞记录到If，在-150 mV时电流幅值约为(86.9±8.4)pA，电流密度约为(0.9±0.1)pA/pF[其电容约为(92.1±7.5)pF]，二者比较有显著差异(n=20,P<0.01)，该电流对CsCl敏感，2 mmol/L CsCl几乎可以将其完全阻断，见图1。

Figure 1. At the test potential of-150 mV,Ifdensities markedly increased in aged rats.

图1老龄大鼠心房肌细胞If电流的记录

2老龄大鼠心房肌细胞IfI-V曲线的特征

从I-V曲线可以看出，随着电位向超极化方向移动，老龄组细胞电流迅速增加，而青年组细胞电流虽有增加，但增加的幅度较小，见图2。

图2老龄大鼠心房肌细胞If电流的I-V曲线

3老龄大鼠心房肌细胞If稳态激活的特征

在青年对照细胞上If的半激活电压(V1/2)为(-104.4±6.3)mV，而老龄组细胞电流的半激活电压为(-87.2±2.3)mV，明显移向静息电位，见图3。同时，激活动力学研究显示，在老龄大鼠的心房肌细胞上电流的激活时间常数(τ)为(230.2±14.4)ms，而青年对照组心房肌细胞的τ则为(670.5±23.6)ms，前者显著快于后者(P<0.01)。

图3老龄大鼠心房肌细胞If电流的稳态激活曲线

4老龄大鼠心房肌细胞If的翻转电位

无论是青年对照组或是老龄组，大鼠细胞的翻转电位相近，老龄组细胞为(-77.3±6.8)mV，而青年对照组细胞(-80.7±5.4)mV，2组比较无显著差异。

5老龄大鼠心房肌细胞If电流对ISO的反应

在细胞外应用1 μmol/L ISO后，老龄大鼠心房肌细胞If电流密度从(3.2±0.4)pA/pF升至(7.3±0.5)pA/pF(P<0.01，n=19)，而青年组心房肌细胞给药后从电流密度(0.9±0.1)pA/pF升至(2.3±0.2)pA/pF(P<0.01，n=19)，可见ISO使老龄大鼠的电流升高约为2.3倍，而青年大鼠的电流升高约为2.6倍，二者升高幅度相近。

讨 论

起搏电流(If)是一种超极化激活的电流, 其通道在-50 mV 水平开始开放，到-120 mV充分开放。其主要成份是Na+和K+，尤其是Na+的内流。它是窦房结细胞的主要离子流，其活动增加，自律性增强。老年人由于心脏组织结构和神经支配改变，特别是窦房结的退行性变，窦房结细胞减少甚至消失，使得窦性心律降低，而潜在起搏点如心房肌细胞起搏电流活动增强，将为异位起搏发生提供条件，起搏电流在异位节律增高方面均起着关键性作用[6,7]。

本研究发现，老龄大鼠心房肌细胞起搏电流的密度和激活均高于青年鼠，且可记录到电流的细胞数也明显增加，提示这可能是老龄大鼠心房容易出现异位起搏和诱发的离子基础。进一步，对通道门控特征的研究发现，老龄大鼠心房肌细胞随着超极化电位的增加，半激活电压向更正的电位方向移动，即移向更接近静息电位。因此，我们推测老龄大鼠心房肌细胞起搏电流的增加与通道激活过程和激活电位改变又密切关系。起搏电流可以被β受体所调控[8,9]，结果显示，β受体激动剂异丙肾上腺素均可使2组的电流增加，但增加幅度在老年组和青年组无较大差异，提示2种细胞上起搏通道电流对异丙肾上腺素反应的敏感性基本一致。本文结果显示对于老年人房颤应注意异位起搏点的发生，更应重视起搏电流在其中所起的作用。

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Characteristicsofpacemakercurrentinagedratatrialmyocytes

LIN Kun1, LAN Yun-feng2, FANG Zhou2, GAO Jin-liao2, WANG Hong-juan2, LI Yang2

(1DepartmentofCardiology,2InstituteofGeriatricCardiology,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China.E-mail:liyangbsh@163.com)

AIM: To investigate the characteristics of pacemker current (If) of atrium myocytes in aged rats.METHODSAged SD rats (22-24 months) were used in the study. The single atrium myocytes were isolated.Ifcurrent was recorded by the technique of whole-cell patch clamp.RESULTSThe densities ofIfincreased markedly in aged rat atrium myocytes compared with that in the cells of young rats. At the test potential of-150 mV, the average amplitude ofIfwas (382±23)pA and the current density was (3.2±0.4)pA/pF, while the average amplitude ofIfin control group was (86.9±8.4)pA and the current density was (0.9±0.1)pA/pF,P<0.01.Ifcurrent was augmented at negative hyperpolarzing test potential. Time constants of activation in aged and control cells were (230.2±14.4)ms and (670.5±23.6)ms, respectively. Furthermore, steady state curves in the elder cells was shifted to positive potentials and the voltages for half maximal activation were (-87.2±2.3)mV (aged cells) and (-104.4±6.3)mV (control cells). In contrast, the slope of activation curves and reversed potential ofIfwere slightly different between aged cells and control cells.CONCLUSIONThe amplitude and densities ofIfin atrium cells of aged rats were larger than that of control rats.

Aged rats; Atrium myocytes; Pacemaker current

R965; R972.2; Q424

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.009

1000-4718(2011)01-0048-04

2010-06-24

2010-10-19

国家自然科学基金资助项目(No.30570739)

△通讯作者 Tel：010-66936762； E-mail: liyangbsh@163.com