通心络对同型半胱氨酸损伤的内皮细胞的基因表达谱的影响*

陈燕铭， 吴 琳， 刘 勇， 周 彬， 王 敏， 刘定辉， 廖火城， 吴伟康， 吴以岭， 钱孝贤,△

(中山大学附属第三医院1内分泌科，2心血管内科，3中山大学中西医结合研究所， 广东 广州 510630；4河北省中西医结合医药研究院，河北 石家庄 050035)

通心络对同型半胱氨酸损伤的内皮细胞的基因表达谱的影响*

陈燕铭1， 吴 琳2， 刘 勇2， 周 彬2， 王 敏2， 刘定辉2， 廖火城2， 吴伟康3， 吴以岭4， 钱孝贤2,3△

(中山大学附属第三医院1内分泌科，2心血管内科，3中山大学中西医结合研究所， 广东 广州 510630；4河北省中西医结合医药研究院，河北 石家庄 050035)

目的探讨通心络对同型半胱氨酸(Hcy)损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的基因表达谱的影响。方法原代培养的HUVECs，随机分为对照组、Hcy组和通心络组，提取总RNA并纯化，反转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针，采用高通量Affymetric人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片(含47 000个基因或基因片段)杂交，杂交信号经扫描和数字化处理，通过生物信息学数据分析推测通心络对同型半胱氨酸损伤的HUVECs细胞功能的影响以及可能的信号通路。结果与对照组相比，Hcy组有4 343个基因表达上调，316个基因表达下调；与Hcy组相比，通心络组有3 409个基因表达上调，121个基因表达下调。这些共同的差异基因生物功能涉及转录因子调控、激酶、细胞骨架与蛋白合成、转运功能、细胞因子、细胞-细胞受体相互作用和细胞黏附因子等。参与的信号通路主要是与血管新生、凋亡、氧化应激、凝血纤溶和炎症等相关的信号通路,如mTOR信号通路、MAPK信号通路和Toll样受体信号通路。结论通心络能导致同型半胱氨酸损伤内皮细胞基因表达谱的改变，这些基因改变可能参与了细胞凋亡、氧化应激和凝血纤溶等过程。

人脐静脉内皮细胞； 高半胱氨酸； 通心络； 基因芯片； 基因表达谱

通心络胶囊是根据络病理论研制的复方制剂，近年来大量临床和动物实验研究表明，通心络可改善内皮功能、抗氧自由基、抗动脉粥样硬化，减轻心肌缺血-再灌注损伤等作用[1,2]。其中，对内皮细胞功能的保护作用是通心络的心脑血管保护作用的重要途径之一。内皮细胞不仅具有屏障作用，而且具有内分泌、调控血管舒缩等复杂的生理作用。同型半胱氨酸是近年来证实的心血管疾病独立危险因子[3]，研究证明血管内皮是同型半胱氨酸作用的重要靶器官。目前，通心络对同型半胱氨酸损伤的内皮细胞保护作用机制尚不明了。本实验采用高通量表达谱基因芯片-人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片[4](CapitalBio, China)对同型半胱氨酸损伤的内皮细胞及通心络对内皮细胞的影响的可能基因组mRNA水平进行全基因组筛查，并采用生物信息学方法对结果进行分析，旨在揭示通心络对内皮细胞作用的分子机制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1芯片 全基因组寡核苷酸芯片HG-U133 Affymetric plus 2.0，包含54 614个探针组，分析47 000个转录体和变异体，其中包括了可能的38 500个已知基因。

1.2仪器与试剂 通心络超微粉胶囊由石家庄以岭药业股份有限公司提供。Poly-A RNA Control Kit，Hybridization Control Kit，R-phycoerythrin Streptavidin，Hybridization Oven 640，Fluidics Station 450，GeneChip Scanner 3000均为Affymetrix产品。

1.3通心络超微粉溶液的制备 通心络超微粉溶液的制备用M199培养液溶解通心络超微粉，配置为50 g/L原液，室温条件下，充分振荡30 min，超声溶解1 min，1 000 r/min离心10 min，取上清用于细胞培养。

2方法

2.1人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)原代培养及鉴定 健康新生儿脐带取自中山大学附属第三医院妇产科；参考Jaffe改良法，无菌收集新生儿脐带，PBS缓冲液反复冲洗静脉腔后灌注0.1%胶原酶消化30 min，含10%血清的M199培养基终止消化，消化液1 000 r/min离心5 min后加入培养液重悬细胞，计数细胞数量，于37 ℃、5% CO2培养箱内培养。待细胞贴壁并85%融合后，用0.05%胰酶消化传代，选择生长良好的第3-5代用于实验。HUVECs经细胞形态学鉴定，而且流式细胞术CD34检测阳性证实。

2.2实验分组 细胞同步化后，分为对照组(培养液不加干扰因素)、同型半胱氨酸 (homocysteine,Hcy)组(0.5 mol/L)和通心络组(Hcy 0.5 mol/L+通心络 5 g/L)，上述各组药物干预48 h。

2.3样品RNA的准备 干预结束,吸干培养液，洗涤细胞后用Trizol(Invitrogen)一步法提取细胞中的总RNA，采用RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen)对总RNA进行纯化。采用分光光度计分析RNA浓度和纯度。

2.4荧光标记和基因芯片杂交 按CapitalBio公司实验操作流程进行，将Cy3-dCTP和Cy5-dCTP(GE Healthcare) 分别标记不同来源细胞总RNA 的转录产物，标记产物纯化后于Hybridization Oven 640中杂交。杂交结束后在Fluidics Station 450洗脱和染色。

2.5扫描、图像的采集与数据分析 采用GeneChip Scanner 3000进行扫描，用GeneChip Operating software (GCOS 1.4)分析软件对芯片图像进行分析，把图像信号转化为数字信号；然后dChip软件做校正和归一化处理。

2.6表达基因的筛选和差异基因的信息学分析 删除荧光信号弱的基因(<1 500)，以及芯片上的阴性对照、内标、外标等冗余的数据，2张杂交膜中相同点的信号强度进行比较得出该基因的信号比值(Cy5/Cy3)，以>2或<0.5倍标准筛选差异表达基因，信号比值>2表示基因上调，而<0.5则表示基因下调。在进行生物信息学分析时，把筛选出的差异表达基因对照KEGG(www.genome.jp/kegg/)和BioCarta(www.biocarta.com)数据库进行途径分析(pathway analysis)。

2.7验证芯片结果 我们挑选4个差异表达基因做实时定量RT-PCR，操作按试剂说明书和仪器操作规程。在ABI Prism 7000荧光定量PCR分析仪进行扩增及定量分析。本实验设定β-actin为管家基因。引物序列见表1。

表1 实时定量PCR的基因序列

3统计学处理

所有基因表达数据的分析均采用Affymetrix公司的GCOS 1.2软件对获得的各杂交点的信号值进行数据处理和分析。将有显著表达差异的基因，上传到Affymetrix分析中心MAS平台 (Molecule Annotation System)(http://bioinfo. capitalbio.com/mas/)进行资料分析，获取每个探针的信息。利用KEGG pathway和Gene Ontology (Go) (http://www.Geneontology.org)分析差异基因在信号通路上的富集程度及分子功能和生物学过程的分类。荧光定量PCR反应结束后由计算机自动计算定量结果，用△△Ct方法进行计算RNA表达量。利用SPSS 13.0 配对样本t检验比较基因芯片实验和定量PCR实验目的基因表达差异统计。将目的基因的相对差异表达水平与Affymetrix芯片实验结果进行比较，判定两者是否一致。

结 果

1样本和芯片质量控制结果

实验中提取的总RNA 所进行的凝胶电泳及分光光度计分析，证实获得了高质量的总RNA。OligoB2、Poly-A controls、hybridization controls等阳性对照信号正常；看家基因信号值及3’/5’比值正常；平均背景值与噪音值较低；present percent数值正常；证实各质控指标符合要求。

2差异表达基因

选择表达差异≥2倍为表达上调基因，而≤0.50倍为表达下调基因。各基因的杂交信号强度分布见图1，该图中每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号，X轴、Y轴分别代表Cy3和Cy5的信号强度，大部分集中在一个接近45°的对角线周围的红点，代表信号差异在0.5-2.0的倍区间，基本属于非差异性表达基因，而一些黄点分布在45°的对角线外，这些点可能是差异表达基因。

分析表明，相比Hcy组，对照组共有4 659个基因出现表达差异，其中，4 343个基因表达上调，316个基因表达下调，部分差异表达基因见表2。对比Hcy组，TXL组共有3 530个基因出现表达差异，其中3 409个基因表达上调，121个基因表达下调，部分差异表达基因见表3。比较TXL组和正常对照组，仅有59个基因出现表达差异，其中，29个基因表达上调，30个基因表达下调。

Figure 1. Scatter spots of hybridization signals on gene chip. A: Hcyvscontrol; B: HcyvsTongxinluo; C: Tongxinluovscontrol.

图1表达谱芯片杂交信号强度双对散点图

表2 Hcy组vs对照组的差异基因

Cy5/Cy3 ratio>2:up-regulative gene; Cy5/Cy3 ratio<0.5:down-regulative gene.

表3 Hcy组 vs 通心络组的差异基因

Cy5/Cy3 ratio>2:up-regulative gene; Cy5/Cy3 ratio<0.5:down-regulative gene.

3通路分析

通过比对KEGG和BioCarta 数据库进行差异基因的途径分析表明，2张芯片(Hcyvscontrol; HcyvsTXL)共同差异基因的可能相关途径列于表4中。其中，影响较大的是凋亡(apoptosis)信号通路、促丝裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信号途径和mROT信号通路等，包括细胞-细胞受体相互作用、细胞黏附分子、脂肪细胞因子信号途径、氧化应激等与内皮细胞增殖、凋亡、物质代谢和氧化应激等的途径均受到影响。部分信号通路见表4。

4实时定量RT-PCR验证基因芯片结果

基因芯片结果与定量RT-PCR的改变倍数(表5)虽然有差异，变化趋势一致，且差异无显著(P>0.05，n=4)，证明基因芯片结果可靠。

表4 差异基因的信号通路

表5实时定量RT-PCR与基因芯片结果比较

Table 5. Testing result comparison of real-time RT-PCR and gene chip(n=4)

GenesGenechipReal-timeRT-PCRHcyvscontrolHcyvsTXLHcyvscontrolHcyvsTXLPRKACB3.012.762.512.36FAS4.123.575.214.87CASP82.282.213.783.57MAP2K42.872.754.545.21

讨 论

高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化的独立危险因子之一，其在心血管疾病的发生发展中的作用尚未明了。其中血管内皮细胞是同型半胱氨酸的重要靶器官。通心络胶囊是运用中医络病理论研制的复方中药制剂。目前针对同型半胱氨酸所致动脉粥样硬化的致病机制研究大部分仍局限在少数几个基因、蛋白的比较分析范畴内，对通心络心血管保护作用的探索也较局限，一般仅在通路水平上进行探讨[5]，这样所提供的信息单一，难以较全面地认识相关基因的表达状况。大量研究证明，基因和蛋白质较少单独起作用，它们往往通过复杂的网络交互作用共同影响生物系统的功能，这些功能高度相关的基因构成基因群。动脉粥样硬化的发生发展过程中存在着极其复杂的调控网络[6]基因芯片是一项高通量筛选技术，具有高通量、自动化、高效率、平行等优点，通过少量标本的分析，能够全面地反映疾病基因表达谱。

GO是Gene Ontology(GO)Consortium(http://www.geneontology.org/)制定的动态受控性词汇表[7]，GO分析是将差异基因进行分类，从中发现不同样本的主要差别。GO将基因分为3大类：分子功能(molecular function)、生物学过程(biological process)和细胞成分(cellular component)。在GO分析中，我们选择可信度P=0.02，所选择的类别中2个组差别明显。(1)在生物学过程中，生物调节相关的差异表达基因主要集中在细胞周期调节、细胞增殖调节、凋亡调节、细胞活性、细胞黏附及细胞定位和功能调控这些功能群，这提示Hcy及通心络参与了细胞周期的调节、增殖和凋亡等关系细胞损伤、修复的生理过程；(2)在分子功能中，差异基因主要集中在催化活性、结合作用、转运活性、信号转导、酶调节活性、分子转导活性、转录调节活性、电子载体活性及结构蛋白活性等，这些生物功能的改变与细胞增殖速度、分裂速度、细胞修复的核酸复制及较复杂的物质转运过程相关；(3)在细胞成分中，大部分集中在细胞器、蛋白结合物及大分子复合物中，其次是膜内腔、胞外区等，提示Hcy可能因对细胞损伤导致部分细胞器活性提高甚至出现细胞器形态学改变，通心络可以部分改善Hcy对细胞成分的影响。按照基因功能分类的GO标准，我们对差异基因进行功能分析，发现这些基因是涉及凋亡相关、信号转导相关、转录相关、免疫相关、生长分化相关和细胞周期相关等不同层次、不同功能的基因，很多基因都参与多种生物学过程，具有多种分子功能，形成网络，因此难以单纯地归为某一类。

KEGG-日本基因和基因组京都百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系统分析基因功能、联系基因组信息和功能信息的知识库[8]，通过更高级的KEGG PATHWAY数据库中，可以详细了解细胞生化过程如代谢、膜转运、信号传递、细胞周期，还包括同系保守的子通路等信息。经KEGG数据分析，Hcy组对比正常组的差异基因中共有81组差异的信号通路，其中38个信号通路差异非常显著(P<0.01)。Hcy组对比通心络组的差异基因中，共有63组差异的信号通路，其中41个信号通路差异非常显著(P<0.01)。将这2批信号通路进行比对，发现共有26组信号通路是共同拥有的，其中包括凋亡通路、MAPK通路、JAK-STAT通路、mTOR通路、VEGF通路及Toll样受体通路等与氧化应激、炎症及免疫反应、凝血纤溶系统等病理生理过程相关的重要信号通路，同时提示通心络可能通过上述信号通路对同型半胱氨酸损伤内皮细胞进行保护，丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内促增殖和传递应激信号的转导通路的核心环节，该家族包括ERK 、JNK、p38等亚族。MAPK可通过磷酸化转录因子、细胞骨架相关蛋白、酶类等底物参与介导生长、发育、分裂、分化、死亡及细胞间的功能同步等细胞生理过程。MAPK磷酸酶激活多种转录因子，影响基因表达，调节细胞增殖。鉴于MAPK与氧化应激、炎症密切相关，因此在动脉粥样硬化的发生过程中起重要作用。研究证明，通心络可通过激活JNK通路[9]、上调NOS-NO通路[10]改善内皮细胞功能。本研究发现MAPK通路中3个亚族中的多个相关基因如PPP3CA、MAP3K7、MAP2K1IP1、RAPGEF2、ZAK表达均有显著差异，提示Hcy与氧化应激、炎症过程密切相关。

本研究通过对同型半胱氨酸损伤内皮细胞的基因表达谱的研究，发现通心络能改善同型半胱氨酸损伤内皮细胞基因表达谱，这些基因改变可能参于了细胞凋亡、氧化应激和凝血纤溶等过程，今后可进一步研究通心络作用的信号通路。

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EffectofTongxinluoongeneexpressionprofilesofendothelialcellstreatedwithhomocysteine

CHEN Yan-ming1, WU Lin2, LIU Yong2, ZHOU Bin2, WANG Min2, LIU Ding-hui2, LIAO Huo-cheng2, WU Wei-kang3, WU Yi-ling4, QIAN Xiao-xian2,3

(1DepartmentofEndocrinology，2DepartmentofCardiology，3InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicineofSunYat-senUniversity,ThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China;4TheIntegrationofTraditionalandWesternMedicalResearchAcademyofHebeiProvince,Shijiazhuang050035,China.E-mail:xiaoxianq@qq.com)

AIM: To explore the effects of Tongxinluo on the gene expression profiles of homocysteine-treated human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).METHODSThe cell injury model was established by treating the HUVECs with homocysteine. Cultured HUVECs were divided into 3 groups: control group (without any treatment), homocysteine group (treated with homocysteine at the concentration of 0.5 mol/L) and Tongxinluo group (trated with homocysteine+Tongxinluo). The total RNA isolated from the cells with Trizol method was purified and reversely transcribed for synthesizing Cy3/Cy5 labeled cDNA probe. The probe was hybridized with microarray-based Affymetric high throughput gene expression profile (47 000 genes or gene fragments) to screen the differentially expressed genes among the cells with different treatment. The effect of Tongxinluo on the biological function of HUVECs and the possible signal pathway were analyzed.RESULTSCompared with the control cells, 4 659 (9.91%) genes were detected to have marked changes with 4 343 up-regulated and 316 down-regulated expression in homocysteine treated cells. Compared with the cells treated with homocysteine, 3 530 (7.51%) genes were detected to have marked changes with 3 409 up-regulated and 121 down-regulated expression in the cells treated with homocysteine+Tongxinluo. These genes were involved in transcription activators, cytoskeleton and protein biosynthesis, transport function, cytokines, cell adhesion molecule and metabolism. Signal pathway analysis indicated that Tongxinluo played roles in certain pathways related to vascular proliferation, apoptosis, oxide stress, coagulation, fibrinolysis and inflammation, such as mTOR, MAPK and Toll-like receptor signaling pathways.CONCLUSIONTongxinluo alters the gene expression profiles of HUVECs injury induced by homocysteine, resulting in the change and modification of cell apoptosis, oxide stress, coagulation and fibrinolysis.

Human umbilical vein endothelial cells; Homocysteine; Tongxinluo; Gene chip; Gene expression profile

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.008

1000-4718(2011)01-0042-06

2010-06-24

2010-11-17

国家重点基础研究发展规划973资助项目(No.2005CB523305);广东省自然科学基金资助项目(No.8151008901000209)；广东省科技计划资助项目(No.2007B060401024)

△通讯作者 Tel: 020-85252168; E-mail：xiaoxianq@qq.com