不同脱毒方法对玉米秸秆水解液酒精发酵的影响

张 强 ，Anders Thygesen，Anne Belinda Thomsen

（1长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130022；2Biosystems Division，Risø DTU，Technical University of Denmark，Denmark）

研究开发

不同脱毒方法对玉米秸秆水解液酒精发酵的影响

张 强1，Anders Thygesen2，Anne Belinda Thomsen2

（1长春理工大学生命科学技术学院，吉林 长春 130022；2Biosystems Division，Risø DTU，Technical University of Denmark，Denmark）

利用湿热预处理（195 ℃，15 min）后的玉米秸秆水解液，考察了3种不同脱毒方法（中和法、饱和生石灰法和Na2SO3法）对水解液中的抑制剂的去除效果，研究了树干毕赤酵母（Pichia stipitis58376）对脱毒后的水解液酒精发酵情况。结果表明：玉米秸秆水解液经过 3种方法脱毒处理后，醛类抑制剂（糠醛和 5-羟甲基糠醛）平均减少41%，总酚类最高去除28.4%，酒精得率都得到明显提高。最佳的脱毒方法是饱和生石灰法，理论酒精得率达到69.31%，对应的酒精浓度和生产效率分别为12.2 g/L和0.056 g/(L·h)。饱和生石灰法是一种有效实用的脱毒方法。

玉米秸秆；湿热预处理；脱毒；树干毕赤酵母

世界原油储量的日益下降，使得人们对探索新的可再生能源产生了极大的兴趣。利用丰富廉价的玉米秸秆等纤维质原料生产燃料酒精不但可缓解能源危机，而且可大大降低二氧化碳的排放，减轻环境污染[1-2]。

玉米秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，结构致密。湿热预处理是一种有效的预处理方法，可使纤维素和半纤维素有效分离[3]。预处理后的水解液由于含有丰富的还原糖等营养物质是酒精发酵很好的原料，但预处理过程中由于糖类及木质素的降解，会释放一些微生物生长的抑制剂，例如糠醛、5-羟甲基糠醛（5HMF）以及酚类等物质，从而影响菌体发酵[4-5]，尤其树干毕赤酵母（Pichia stipitis）对抑制剂非常敏感，往往不能够进行发酵。抑制剂的种类和数量与原料和预处理条件有关。因此发酵之前应进行必要的脱毒处理。目前使用的脱毒方法较多，其中饱和生石灰法和Na2SO3法是常用的有效的脱毒方法，广泛应用于各种水解液的脱毒处理[6-7]，而中和法是比较简单易行的脱毒方法。但由于原料、预处理方式以及发酵微生物不同，各种脱毒方法之间难于进行比较。

本文主要考察了3种脱毒方法——中和法、饱和生石灰法和 Na2SO3法对玉米秸秆水解液中抑制剂的去除效果，并利用树干毕赤酵母（Pichia stipitis58376）对脱毒后的水解液酒精发酵进行了研究。

1 材料与方法

1.1 菌种和细胞生物量

树干毕赤酵母（Pichia stipitis58376）购买后保存在丹麦瑞素国家实验室。首先 30 ℃培养过夜，然后3000 r/min离心5 min，重新悬浮在无菌水中作为发酵种子备用。菌体离心，105 ℃干燥至恒重进行细胞生物量测定[8]。

1.2 原料

玉米秸秆来自意大利，2004年7月份收获，首先经过气流干燥，然后粉碎成粒径为1 mm备用。

1.3 水解液样品制备

湿热预处理是在丹麦瑞素国家实验室环行高压容器中进行的。本实验所采用的实验条件是基于前期所做的玉米秸秆湿热预处理的基础上进行的。195 ℃，预处理15 min是已报道的最佳条件[9]。将60 g玉米秸秆原料（绝干）与1 L水混合，195 ℃预处理15 min，反应结束后，将预处理液过滤处理并添加适量葡萄糖作为水解液样品。

1.4 脱毒方法

1.4.1 中和法

利用 Ca(OH)2将玉米秸秆水解液 pH值调到5.5，静置1 h后过滤。

1.4.2 饱和生石灰法

采用饱和石灰石乳液与玉米秸秆水解液快速搅拌混合，首先将pH值调到10.0，静置1 h后过滤，然后用浓H2SO4酸化到pH值5.5，静置过滤。

1.4.3 Na2SO3法

将 1.4.2节处理好的水解液加入 Na2SO3（3 g/L），静置1 h后过滤。

1.5 水解液的组成分析

水解液中醛类及还原糖（葡萄糖、木糖）由液相色谱（HPLC）测得。柱子为 Aminex HPX-87H（BIO-RAD），温度63 ℃，流动相4 mol/L H2SO4，流速0.6 mL/min。检测器为日本Shimadzu公司生产。

1.6 总酚类测定

采用普鲁士蓝法，具体参考文献[10]。

1.7 发酵

发酵是在250 mL玻璃瓶中进行的。100 mL水解液接入发酵种子使细胞干重达到 2 g/L，并加入0.2 mL（24%）的尿素溶液。配好发酵栓，发酵在30 ℃进行。酒精生成量可以通过因 CO2的释放引起瓶重变化监测，发酵液中酒精浓度最终由 HPLC测得，试验重复3次。

1.8 计算

1 g葡萄糖理论上产生0.51 g酒精。酒精产量可以通过因CO2的释放引起瓶重变化监测[11]。酒精产量= CO2减少量× 1.045

2 结果和讨论

2.1 预处理后玉米秸秆水解液抑制剂组成

玉米秸秆经过预处理主要产生3类抑制剂——醛类、羧酸类和酚类。糠醛和5HMF 是主要的醛类抑制剂，由糖类降解生成。醛类物质会抑制醇脱氢酶及糖酵解酶的活性，从而影响酒精发酵。乙酸和甲酸是主要的羧酸类抑制剂，乙酸是由半纤维素中乙酸根基团水解形成，而甲酸是由糠醛和5HMF降解形成。由于 25 ℃乙酸的电离常数为4.76，未解离的乙酸与pH值有很大关系，会透过细胞膜影响细胞生长而产生抑制作用，研究表明维持相对较高的发酵pH值将会减轻乙酸的抑制作用。而酚类主要由木质素降解形成，目前已鉴别出来的酚类物质有几十种，酚类物质能将细胞膜分化，从而影响膜的完整性，是微生物酒精发酵中最重要的一类抑制剂[12]。抑制剂的种类主要与原料及预处理条件有关，表1显示了玉米秸秆经过湿热预处理后水解液中主要抑制剂的含量。

2.2 脱毒后玉米秸秆水解液中抑制剂变化

采用中和法、饱和生石灰法和 Na2SO3法分别对玉米秸秆水解液进行了脱毒处理。从表2可以看出，抑制剂的去除与使用的脱毒方法有关。所使用的脱毒方法可以使醛类平均减少41%，最高的是采用Na2SO3法，可使醛类物质去除44.3%。而对于酚类物质，采用饱和生石灰法可得到 28.4%去除率。而 Na2SO3法则没有效果。有趣的是中和法和饱和生石灰法一样，能够有效改变水解液中的醛类和酚类物质的含量。

表1 预处理后玉米秸秆水解液抑制剂组成

表2 脱毒方法对抑制剂的影响

2.3 不同脱毒方法对酒精发酵影响

利用树干毕赤酵母（Pichia stipitis58376）对脱毒后的玉米秸秆水解液进行了酒精发酵实验。以纯葡萄糖和木糖组成的合成培养基（葡萄糖35 g/L，木糖0.5 g/L，24%尿素2 mL/L）作为空白对照。

表3展示了脱毒方法对酒精发酵的影响。受脱毒方法的影响，还原糖会有不同程度的损失。从图1可以看到，3种脱毒方法都有效提高了酒精的得率。最佳的脱毒方法是饱和生石灰法，理论酒精得率达到69.31%，对应的酒精浓度和生产效率分别为12.2 g/L和0.056 g/(L·h)。根据报道木质素降解产物酚类更有毒性[13-14]，由于有效地去除了部分酚类物质和醛类物质，与其它方法相比，饱和生石灰法获得了较高的菌体生物量，最终酒精含量较高。另外从图2中也看到，尽管经过脱毒处理，水解液中的还原糖都没有被P. stipitis完全利用，利用率在80%～90%之间，主要由于脱毒部分移去了抑制剂的缘故。

表3 脱毒方法对酒精发酵的影响

图1 脱毒方法对酒精形成的影响

图2 脱毒方法对还原糖消耗的影响

3 结 论

（1）经过湿热预处理得到的玉米秸秆水解液，经过中和法、饱和生石灰法和Na2SO3法脱毒处理，可以使水解液中糠醛和5HMF平均减少41%，最高的是采用Na2SO3法，醛类物质去除率为44.3%。而对于酚类物质，采用中和法和饱和生石灰法可分别得到10.6%和28.4%去除率，而Na2SO3法则没有效果。

（2）利用树干毕赤酵母（Pichia stipitis58376）对脱毒后的玉米秸秆水解液进行酒精发酵，3种脱毒方法都有效提高了酒精的得率。最佳的脱毒方法是饱和生石灰法，理论酒精得率达到69.31%，对应的酒精浓度和生产效率分别为 12.2 g/L和 0.056 g/(L·h)。

（3）饱和生石灰法是一种有效实用的脱毒方法。为提高酒精得率，还可以进一步优化发酵工艺条件。

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Effect of different detoxification methods on ethanol production from corn stover hydrolysate

ZHANG Qiang1，Anders Thygesen2，Anne Belinda Thomsen2
（1School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022，Jilin，China；2Biosystems Division，Risø DTU，Technical University of Denmark，Denmark）

The influence of three different detoxification methods（neutralization，overliming and Na2SO3addition）on inhibitors were evaluated by using corn stover hydrolysate prepared with hydrothermal pretreatment（195 ℃，15 min）. Ethanol fermentability of detoxified corn stover hydrolysate was investigated byPichia stipitis58376. The results showed that all the employed detoxification methods resulted in a 41% reduction in average total furans and highest 28.4% reduction in total phenols. Fermentation performance was greatly enhanced by employed detoxification methods.Ethanol yield of 69.31% of the theoretical value based on reducing sugar was obtained by overliming.The corresponding ethanol concentration and volumetric productivity were 12.2 g/L and 0.056 g/（L·h）.Overliming was the most efficient detoxification method.

corn stover；hydrothermal pretreatment；detoxification；Pichia stipitis

TK 6

A

1000-6613（2011）04-0739-04

2010-12-19；修改稿日期：2010-12-04。

吉林省教育厅科技项目（200623）。

及联系人；张强（1969—），男，副教授，主要从事生物质能源的研究。E-mail corn11@126.com。