定量测定体外诊断试剂的线性评估方案及数学操作程序的研究——体外诊断试剂产品的系列研究（五）

北京市药品监督管理局医疗器械技术审评中心（100053）于泳 薛玲

线性是定量测定体外诊断试剂产品的关键指标，也是产品上市前审批的主要内容之一。但目前国内还没有体外诊断试剂产品线性评价方法的有关标准及明确要求。本文通过参考美国国家临床实验室标准委员会（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）制订的评价方案（EP6-A，定量测量方法的线性评价：一种统计学方法；批准指南）（EP6-A：Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures:A Statistical Approach; Approved Guideline），结合国内的有关法规及相关标准，摸索出定量测定体外诊断试剂的线性评估方法，即通过多项式拟合验证线性偏差是否满足临床可允许误差，进而确定产品的线性范围，在给出线性评估方法的基础上，文中也对有关的数学操作程序及统计学方法进行了描述。

1 线性评价方案

线性是指在给定的测量范围内，使测定结果与样本中分析物的量直接成比例的能力。本方案采用多项式法进行临床实验室定量测定方法的线性评价。多项式线性评价首先假定数据组为非线性，并假定在不存在随机误差的情况下，数据点正好落于一条直线或曲线上。

附表1 样本配制方案

续附表1 样本配制方案

附表2 样本配制方案

具体的评价方法包括两部分，第一部分检验非线性多项式是否较线性多项式与数据更为相符。当非线性多项式较线性多项式更符合时，进行方法的第二部分，评估最适非线性多项式与线性多项式间的差异是否小于预先设定的临床可允许误差，同时对测定结果的精密度进行检验，以提高统计功效。

2 线性评价方案的总体设计

2.1 评估方案的确定

2.1.1 要确定样本类型，为避免基质效应对结果的影响，进行线性评价时所选用的样本应与临床实验样本相似，但不可采用含有对测定方法具有明确干扰作用的样本，如溶血、脂血、黄疸或含有某些特定药物的样本。理想样本为分析物浓度接近预期测定上限的病人混合血清，可用其他病人样本将其稀释为预定浓度。EP6-A中建议应尽可能按以下顺序进行样本种类的选择：①病人混合血清；②用适当稀释液稀释的病人血清；③添加分析物的病人样本；④用处理过的低浓度物质或处理过的血清物质稀释的病人血清；⑤商业质控品/校准品/线性物质；⑥使用生理盐水稀释的样本；⑦稀释不足或过度稀释的商业质控品；⑧水溶液；⑨其他溶剂的溶液。

2.1.2 要确定样本数量，EP6-A中针对不同目的给出了建议的样本数；建立线性范围：建议9至11个浓度，每个浓度下重复2至4次；验证内部方法或修正方法：建议7至9个点，每个浓度重复2至3次；验证线性范围在实验室有效：建议5至7个浓度，每个浓度重复2次；应注意当建立方法的线性范围时，应有20%到30%的样本的浓度范围超出预期的测量范围，但在可接受的线性响应范围内。

由于EP6-A中也强调了重复测定的次数应足以对每一浓度的样品建立可信的评估。对于某些分析物，在一定的浓度时可能需要3-5次重复测试，并且明确了对不同的浓度采取不同的重复次数不会对系统的评价产生不利的影响。因此验证人员可以根据产品特性对需要的重复测定次数做出选择。

2.1.3 根据确定的样本浓度数量制备不同浓度水平的样本。EP6-A的附录A中给出了5到11个等间距浓度样本的参考分配方法（见附表1、续表1）。为了减少因称量或复溶样本时产生的误差，笔者也认为可以采用将高浓度混合样本进行倍比稀释的方法，得到等浓度间隔的不同浓度水平样本，但采用这种方法时应考虑增加高浓度的样本数。附表2给出的采用倍比稀释方法的9个浓度样本的参考配制方案，其中9号样本为高浓度混合样本，7号样本为9号样本倍比稀释即9号样本浓度的1/2，6号样本为7号样本倍比稀释，以此类推分别得到5至1号样本。为了增加高浓度的样本数，样本序号8的高浓度样本浓度为序号7与序号9样本浓度之和的一半。

2.2 数据分析方法 完成方案设计后，可对样本进行测试，EP6-A建议所有样本在一次运行中或几次间隔很短的运行中随机测定，实验最好在一天之内完成。在对测试结果进行数据分析前，应检查数据中有无由于偶然差错引起的离群值（outlier），对实测值和稀释值进行排序，求每个梯度实测值的平均值、标准偏差及变异系数，并进一步得到每个实测值与对应均值的偏差，每个均值的偏差应小于等于规定倍数的标准偏差。如果均值的偏差大于规定倍数的标准偏差，其对应的测试值即为离群值，应补充测试。

应用统计学软件，选择实测平均值数据作为因变量，梯度数据作为自变量。生成回归模型表、方差分析表、回归系数表及多项式回归的拟合曲线。

在进行线性判断的同时，须判断精密度是否符合要求。多项式回归分析方法要求测量数据具有较高的测量精密度，否则会降低统计功效（低功效的统计不能得出正确的线性判断）。

数据精密度检验方法见

其中，回归标准误差（σ）可利用统计学软件给出或用

计算得到。公式一中，PctBnd 表示具有临床意义的临界相关界值，对大多数分析物PctBnd取5%，最佳拟合方程的回归标准误差：总平均浓度S：样本数R：重复测量的次数C为常数，可根据最佳拟合方程的阶数得到。不精密度界值的常数计算如下。最佳拟合方程的阶数：一阶或二阶，三阶；对应的精密度界值的常数（C）分别为6.3和6.5。公式2中，yi：各个测量值；p（xi）：最佳拟合方程的拟合值；n：样本数乘以重复次数；d：最佳拟合方程的阶数。

精密度符合要求后，可进行线性的判定。在生成的文件里，可得到拟合的一级多项式，二级多项式，三级多项式。多项式回归方程：级数为一级、二级、三级；对应的多项式分别为Y=b0+b1X，Y=b0+b1X+b2X2，Y=b0+b1X+b2X2+b3X3；对应的回归自由度（Rdf）分别为2、3、4。

根据EP6-A的方法，检查对非线性系数进行t检验的Sig，若Sig≥0.05，则对应的非线性系数等于0。检验结果分为以下三种情况：

第一种：对拟合三级曲线的b2和b3进行检验，所对应的Sig值均≥0.05，则b2=0；b3=0；此三级曲线不是最佳拟合曲线。对拟合二级曲线的b2进行检验，所对应的Sig值≥0.05，则b2=0；此二级曲线不是最佳拟合曲线。因此，此次最佳拟合线性为Y=b0+b1X。称为临床标准的线性或一阶线性。第二种：对拟合三级曲线和二级曲线的b2或b3进行检验，所对应的Sig≤0.05，则非线性系数≠0；此次最佳拟合不是一级线性。对非一级线性者，须进一步计算最佳拟合曲线与直线的平均差异值（Average deviation from linearity，ADL）。如ADL＜临界值，判定为临床可接受的非线性，即二阶或三阶线性。第三种：如ADL＞临界值，判定为临床不可接受的非线性，即非线性。

其中，ADL值可按

进行计算，p(x)：最佳拟合二阶或三阶方程的拟合值；b0+b1Χ：拟合一阶方程的拟合值；S：样本数；总测量数据的平均值（S1+S2+S3+……+Sn）/n。

根据是否成线性的结果验证产品的线性范围。

综上所述，笔者参考EP6-A，通过对不同浓度水平样本的测试，并进行线性评价分析，验证产品的线性范围。文中也对有关的数学操作程序及统计学方法进行了描述，希望可以对定量测定体外诊断试剂产品的上市前审批提供一些参考和帮助。