动态浊度法定量检测毛冬青注射液中细菌内毒素

广东省韶关市药品检验所（512024）王莉蓓 陈华龙 严晓明 姜丽君

笔者通过动态浊度法定量检测毛冬青注射液中的细菌内毒素含量，建立毛冬青注射液中细菌内毒素定量分析的方法。

1 材料与仪器

毛冬青注射液（批号：090101、090106、090908，规格：2ml/支，含毛冬青提取物40mg，广东省博罗先锋药业集团有限公司）；动态浊度鲎试剂（批号0807252，1.25 ml/支，湛江安度斯生物有限公司）；细菌内毒素工作标准品（批号：150601－200861，150/支，中国药品生物制品检定所）；细菌内毒素检查用水（批号：0809080，5ml/支，湛江安度斯生物有限公司）；BET-32B型细菌内毒素测定仪（天津大学无线电厂）（检测光源405nm）；ZH-2型漩涡混合器（天津药典标准仪器厂）。METTLER TOLEDOsevenEasy pH酸度计（梅特勒）；UV-2550型紫外分光光度计（岛津）。

2 方法与结果

2.1 细菌内毒素限值的确定 按细菌内毒素限值公式L=K/M，K为人用每kg体重每1h最大可接受的内毒素剂量，非放射性注射剂的K值为5.0 Eu/kg·h，M为1h内每kg体重最大给药剂量。毛冬青注射液用量一次2ml，其L值为L=K/M＝5/2/60＝150Eu/ml。

2.2 标准曲线的制作及可靠性[2]用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品进行溶解稀释，使其最终内毒素浓度分别为5.0，1.0，0.2，0.04Eu/ml稀释系列。各取0.2ml分别加到预先加有0.1ml动态浊度鲎试剂反应管内，混合均匀。立即插入BET-32B型细菌内毒素测定仪进行自动检测，其中每一浓度做2支平行管，并同时做2支阴性对照管（NC）。结果见附表1。结果标准曲线为 lgT=2.7465±0.22252lgC，r=0.9931，|r|>0.980。标准曲线最低内毒素浓度点λ1＝0.04 Eu/ml，阴性对照内毒素均小于标准曲线最低点，标准曲线成立。

附表1 标准曲线的可靠性试验

2.3 干扰实验

2.3.1 供试品最大稀释倍数计算[2]按公式MVD=L·C/λ，毛冬青注射液的L＝150Eu/ml，C为1.0ml/ml，选取0.04～5.0Eu/ml的范围测试。标准曲线的最低内毒素浓度λ1为0.04Eu/ml，其最大稀释倍数均为MVD＝150·1.0/0.04＝3750

2.3.2 供试品溶液配制及干扰预实验 将毛冬青注射液（批号090101），用细菌内毒素检查用水依次稀释为1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200等比系列稀释液，作为供试品空白管（Et）。同时另分别取内毒素标准溶液浓度为2λ（λ为中点浓度0.5Eu/ml）和供试品各等比系列的2倍浓度稀释液，在稀释用试管中等量混合，得到在此稀释倍数下含λm内毒素的供试品溶液，作为供试品阳性管（Es）。分别取上述溶液各0.2ml加入预先加有0.1ml动态浊度法鲎试剂反应管内，混合均匀。立即插入BET-32B型细菌内毒素测定仪进行自动检测，其中每一浓度做2支平行管，并同时做2支阴性对照管（NC），2支阳性对照管（PC），计算回收率。回收率（%）=Es－Et/λ×100%，结果见附表2、附表3。

从附表2、3中可见，供试品等比稀释液中，1∶200，1∶400，1∶800，稀释液的回收率分别为513%、352%、96%。稀释液1:1600，1：3200，稀释液的回收率分别为107%和85%。1：1600，1：3200的回收率均在50%～200%，符合《中国药典》规定。在日常检查中，选1：3200稀释液。

附表2 毛冬青注射液预干扰实验结果

附表3 毛冬青注射液预干扰实验结果

2.4 定量检查 根据以上预干扰实验结果，对3批毛冬青注射液以1：3200稀释液进行定量检查。见附表4。

2.4.1 干扰影响的试验 毛冬青注射液在日常检查中其回收率要在有效范围时，其稀释倍数为1：3200。而供试品对检测光源的吸收及pH值对试验有一定影响。对检测光源的吸收试验：检测光源的波长为405nm。毛冬青注射液（批号批号：090101）用细菌内毒素检查用水稀释成本次实验系列浓度，用岛津UV-2550型紫外分光光度计定点405nm波长处测定吸收值。pH值试验：毛冬青注射液（批号批号：090101）原液及本次实验系列浓度，结果见附表5。

附表4 毛冬青注射液定量检查结果

附表5 毛冬青注射液对检测光源的吸收试验及pH值试验

3 讨论

3.1 中药注射液对对检测光源有吸收，引起干扰。如毛冬青注射液，在对检测光源的吸收试验结果可见，毛冬青注射液在50～1600倍稀释液对检测光源405nm有较大的吸收作用，故光源吸收是主要的干扰原因。建议在做中药注射液细菌内毒素动态浊度法检测时，根据其最大稀释倍数配成等比系列，首先在检测光源405nm进行检测，通过对检测光源的吸收试验，快速筛选出试验浓度范围。

3.2 中药注射剂成分复杂，含β－葡聚糖类似内毒素物质，用动态浊度法定量检测时，要观察反应曲线，考察样品的干扰，可判定是类似内毒素物质的反应，还是供试品自身的内毒素反应。