蕲艾总鞣酸对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用

洪宗国,易 筠,王 东

(中南民族大学药学院,武汉430074)

蕲艾总鞣酸对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用

洪宗国,易 筠＊,王 东

(中南民族大学药学院,武汉430074)

通过Fenton反应产生OH,连苯三酚自氧化产生O-2·模型,研究了蕲艾总鞣酸体外清除自由基作用.结果显示:蕲艾总鞣酸在1.0～10.0 mg/mL范围内对羟自由基和超氧阴离子自由基均具有清除作用,两者均呈现明显的量效关系,最有效的清除浓度均为8.0mg/mL,清除自由基能力均高于同等浓度的甘露醇,但低于同等浓度的抗坏血酸.

蕲艾总鞣酸;羟自由基;超氧阴离子自由基;抗氧化

艾(A rtem isia argy iL evl et V ant)是菊科多年生草本植物,为传统中药[1,2],具有散寒止痛、温经止血的功效[3].近年随着对自由基研究的深入,人体内自由基被认为是引发癌变,衰老和细胞损伤的重要原因,筛选出具有清除自由基能力的天然抗氧化剂已成为世界研究热点[4-6].鞣酸是一种广泛存在于植物中的多酚类物质,由于其自身所具有的多酚羟基结构而具有较强的抗氧化能力.但有关蕲艾总鞣酸抗氧化能力的文献尚未见报道,因此本文利用超声法提取蕲艾中总鞣酸,并以Fenton反应产生羟自由基模型,以邻苯三酚自氧化产生超氧阴离子模型,通过紫外和可见分光光度法研究蕲艾中总鞣酸对·OH和O-2·的体外清除作用,以期探讨蕲艾鞣酸体外清除自由基的能力,为其作为一类新的抗氧化剂的的应用提供一定的理论和实验依据.

1 仪器与试剂

1.1 仪器

KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);RE-52C旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);752紫外光珊分光光度计(上海第三分析仪器厂);HH-2恒温水浴锅(金坛市科兴仪器厂);BT-224S电子分析天平(北京赛多斯仪器系统有限公司);SHZ-3(Ⅲ)型循环水式真空泵(河南省予华仪器有限公司).

1.2 试剂

丙酮、盐酸、石油醚、无水乙醇、过氧化氢、甘露醇、抗坏血酸 (V c)、邻苯三酚、硫酸亚铁、水杨酸、三(羟甲基)氨基甲烷(T ris)焦性没食子酸 (分析纯),均购自武汉化学试剂公司.艾叶采自湖北省蕲春县,采集日期均为2008年端阳节,品种鉴定由湖北省蕲春县医药工业办公室郭双喜(工程师)完成.

2 实验方法

2.1 蕲艾总鞣酸的提取

蕲艾中鞣酸为水溶性多酚类物质,提取工艺采用超声波提取法[7]:称取60 g蕲艾,置于2 L烧杯中,加丙酮-水混合溶剂(V丙酮∶V蒸馏水=4∶6)1500 mL浸泡1 h后,于超声时间20 m in、温度60℃,功率150W 条件下超声提取,减压抽滤,用旋转蒸发仪40℃浓缩至溶液无酮味并石油醚去脂3次,水溶液部分浓缩得鞣酸浸膏,将浸膏以水溶解配置成不同浓度溶液备用.

2.2 蕲艾鞣酸对超氧阴离子自由基的清除作用

连苯三酚发生自氧化反应,生成超氧阴离子自由基O-2·与连苯三酚氧化中间产物,该中间产物于λ=320 nm 处有一特征吸收峰.当加入抗氧化剂时,邻苯三酚自氧化过程受阻,O-2·的生成受到抑制,溶液在320 nm处吸收减弱,故通过测定吸光值变化可推断样品对O-2的清除作用[8].

取5.6 mL T ris-HCl缓冲液(50 mmol/L,pH值8.2),分别加入0.2 mL蕲艾总鞣酸提取液、甘露醇和抗坏血酸溶液,于25℃放置10 m in,分别加入0.2 mL预热至25℃的邻苯三酚(60 mmol/L),反应4 m in后滴加10 mol/L盐酸终止反应,以蒸馏水补足体积,于320 nm 处测其吸光值A0,空白实验以等量蒸馏水0.2mL代替抗氧化剂溶液,测定其吸光值Ax.用5.6 mL T ris-HCl缓冲液、2滴10 mmol/L HCl及0.2mL抗氧化剂溶液调零点,以扣除试样本身颜色的影响,平行测定3次,取平均值,并通过以下公式计算各种抗氧化剂对超氧阴离子自由基的清除率(清除率S=(Ax-A0)/Ax×100%).

2.3 蕲艾鞣酸对羟基自由基的清除作用

H2O2与Fe(Ⅱ)混合后产生的·OH 的Fenton反应中,·OH具有很高的反应活性,存活时间短,在反应体系中加入水杨酸,能有效地捕捉·OH并产生紫红色产物.该产物在510 nm处有强吸收,若加入羟自由基清除剂,可使有色产物的生成量减少,采用固定反应时间法,于510 nm处测定含被测物的溶液吸光度,并与空白组对照,即可确定提取液对羟基自由基的清除作用[9].

在10 mL容量瓶中依次加入6 mmol/L的硫酸亚铁水溶液1 mL,6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1 mL后,将节2.2中不同浓度的抗氧化剂1 mL分别加人瓶中,然后加入0.1%的过氧化氢1mL,以蒸馏水补足体积,摇匀后于37℃水中温育30 m in,测510 nm 处的吸光度值A0.空白实验以等量蒸馏水代替抗氧化剂溶液,测定其吸光值Ax.以1mL 6mmol/L FeSO4和1 mL 0.1%H2O2加抗氧化剂溶液调节零点,以扣除试样本身颜色的影响.平行测定3次,取平均值.计算并比较几种抗氧化剂对羟基自由基的清除率.

3 结果与讨论

3.1 蕲艾鞣酸对超氧阴离子自由基的清除作用

采用邻苯三酚自氧化体系产生超氧阴离子自由基,然后分别加入1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mg/mL 蕲艾鞣酸、V c、和甘露醇溶液,于320nm 处测定吸光度.结果见表1,并得出3种抗氧化剂对超氧阴离子自由基的清除率(见图1).

表1 3种抗氧化剂浓度与吸光度的关系(x±s,n=3)Tab.1 Relationship between concentration of three anti-oxidation and absorbance(x±s,n=3)

由图1知,各抗氧化剂对超氧阴离子自由基清除作用随浓度的增加而增大,浓度为10.0 mg/mL时,蕲艾鞣酸、V c、甘露醇的清除率分别可达66.2%,96.7%,63.5%,但当鞣酸浓度大于8.0 mg/mL时,清除作用呈缓慢下降趋势,因此鞣酸清除作用的最有效浓度为8.0 mg/mL,最大清除率为70.9%.

图1 不同抗氧化剂对超氧阴离子自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of different anti-oxidation on O-2·free radical

直线回归分析,当浓度范围为1.0～8.0 mg/mL得蕲艾鞣酸清除率回归方程Y=42.298+3.724 4X,r=0.98统计学结果表明药物浓度与清除率具有较好的线性关系,且成正相关,说明蕲艾鞣酸此范围对超氧阴离子自由基具有一定的清除作用,且成较好的量效关系.

3.2 蕲艾鞣酸对羟基自由基的清除作用

采用Fenten反应体系产生羟自由基,分别加入1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0 mg/mL的蕲艾鞣酸、抗坏血酸和甘露醇溶液,于510 nm波长处测定吸光度.结果见表2,并得出3种抗氧化剂对羟自由基的清除率.结果见图2.

表2 3种氧化剂的浓度与吸光度的关系(x±s,n=3)Tab.2 Relationship between concentration of three anti-oxidation and absorbance(x±s,n=3)

由图1知,各抗氧化剂对羟自由基清除作用随浓度的增加而增大,当浓度为10.0 mg/mL时,蕲艾鞣酸、V c、甘露醇的清除率分别可达71.3%,88.1%,67.2%,但当鞣酸浓度大于8.0 mg/mL时,清除作用呈缓慢下降趋势,因此鞣酸清除作用的最有效浓度为8.0 mg/mL,最大清除率为74.2%.

直线回归分析,当浓度范围为1.0～8.0 mg/mL得蕲艾鞣酸清除率回归方程Y=43.971+4.011 6X,r=0.97统计学结果表明药物浓度与清除率具有较好的线性关系,且成正相关,说明在此范围蕲艾鞣酸对羟自由基具有一定的清除作用,且成较好的量效关系.

图2 不同抗氧化剂对羟自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of different anti-oxidation on·OH free radical

通过节3.1和节3.2的实验结果,说明蕲艾鞣酸对超氧阴离子自由基和羟自由基均有较好的清除作用,并随蕲艾鞣酸浓度的增加对自由基的清除能力增强,但当浓度大于6.0 mg/mL时,清除趋势放慢,清除率变化不大,当浓度大于8.0 mg/mL时,清除呈下降趋势.可见蕲艾鞣酸对超氧阴离子自由基和羟自由基的清除均具有一定的饱和效应,低浓度时清除很快,且有较好的量效关系.蕲艾鞣酸清除自由基的过程存在饱和机制,是由于鞣酸对自由基的清除作用是分子与分子间的反应.当鞣酸摩尔浓度小于自由基摩尔浓度时,随着鞣酸浓度增加,清除率增加.但当鞣酸摩尔浓度达到并超过自由基摩尔浓度时,每个鞣酸分子可能无法找到其清除的自由基对象,摩尔浓度的自由基清除率便开始下降.

由图1和图2可见V c和甘露醇同样存在浓度饱和效应,但3个物质出现饱和现象的拐点不同.V c和甘露醇分别为4.0 mg/mL,而鞣酸6.0 mg/mL.基于清除自由基与自由基是分子与分子间的反应,因而需使用摩尔浓度进行衡量.笔者在不知鞣酸分子量情况下代之以重量浓度衡量.就理论而言,由于各物质对抗自由基的能力不同,而不应使用重量浓度衡量.假定抗自由基分子与自由基分子存在一个等摩尔(1∶1)反应关系,当自由基摩尔浓度确定时,则不同清除自由基物质出现饱和的摩尔浓度也应一致,因而可按出现饱和拐点时物质的摩尔浓度计算未知物质的平均分子量.分子量V c为176.1,甘露醇为182.2,由计算可初步估计蕲艾鞣酸平均分子量为273.3;总鞣酸为混合物,平均分子量较单一鞣酸分子的分子量低,鞣酸分子量一般在500～3000[10],说明混合鞣酸中还存在很多不具有清除自由基作用的杂质存在,纯净鞣酸的清除效果应更好,此结论需进一步对蕲艾鞣酸的种类和结构进行研究而予确认.

将鞣酸、V c和甘露醇的质量浓度换算成摩尔浓度并对上述图2和图3进行修正,得到清除率同摩尔浓度的变化曲线见图3和图4.由2图结果可知,蕲艾鞣酸确实具有体外清除超氧阴离子自由基和羟自由基的作用,且清除效果均强于甘露醇而不及V c.

图3 不同抗氧化剂对超氧阴离子自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of different anti-oxidation on O-2·free radical

图4 不同抗氧化剂对羟自由基的清除率Fig.4 Scavenging rate of different anti-oxidation on·OH free radical

4 结语

本研究结果表明,蕲艾鞣酸可通过清除活性氧自由基发挥抗氧化作用,对羟自由基和超氧阴离子自由基具有较强的清除作用,且其清除作用优于常用的食品添加剂甘露醇,说明蕲艾鞣酸为一种较强的抗氧化剂和活性氧清除剂,具有延缓衰老的功效.可作为药品、化妆品、食品进行广泛应用.

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Scavenging of Hydroxyl and Superoxide Free Radical by Tann in fromA rtem isia argyi

H ong Zongguo,Y i Yun,W ang D ong
(College of Pharmacy,South-CentralU niversity for N ationalities,W uhan 430074,China)

Hydroxyl free radical,·OH and superoxide anion free radical,O-2· scavenging effects of the total tannin fromA etem siae argy iwere studied.The results showed that theA etem siae argy itotal tannin,1～10 mg/mL in vitro had scavenging activity on hydroxyl and superoxide radical by the autoxidation of pyrogallol production at the concentration of 1.0～10.0 mg/mL w ith dose dependent mode.The available concentration of scavenging activity on hydroxyl radical and superoxide radicalwas 8.0 mg/mL.A rtem isia argy iscavenging activity on radical were more than mannitol,but less than vitam in C at the same concentration

A etem siae argy itotal tannin;hydroxyl radical;superoxide;anti-oxidation effect

Q 504;Q 949.783.5

A

1672-4321(2011)01-0050-04

2010-07-14 ＊通讯联系人 易 筠(1985-),女,硕士研究生,研究方向:天然产物化学,E-mail:crystalyexuan@qq.com

洪宗国(1958-),男,教授,研究方向:天然产物化学,E-mail:hongzongguo@yahoo.com.cn

湖北省科技攻关计划资助项目(2006AA 302A 01)