万寿菊中叶黄素的提取皂化工艺研究

赵洁,尹俊涛,郭亚可,李超鹏,陈文

(石河子大学药学院,832000)

万寿菊中叶黄素的提取皂化工艺研究

赵洁,尹俊涛,郭亚可,李超鹏,陈文

(石河子大学药学院,832000)

该文以四氢呋喃和乙醇的二元混合溶剂为主要提取剂,对万寿菊颗粒中叶黄素的提取皂化工艺进行了研究。实验分别考察了加入四氢呋喃与乙醇的比例、反应时间、料液比、加水体积、加碱量、反应温度对叶黄素得率的影响。在单因素试验的基础上,选取影响较大的4个因素采用L9(34)正交试验考察对叶黄素得率的影响,以得率为指标,确定最佳工艺条件为A1B2C2D3,即料液比为1∶20,加碱质量1.6 g,反应时间4 h,THF∶乙醇=2∶8。由此可知:此条件下叶黄素得率为1.14%,所得浸膏中叶黄素的含量达到10.32%。

万寿菊;叶黄素;提取皂化;正交试验

叶黄素是天然类胡萝卜色素的一种,又名“植物黄体素”[1],具有色泽鲜艳、着色力强、安全无毒、富含营养等特点,被广泛应用于食品、化妆品、医药、烟草、禽类饲料等领域[2-4]。随着对叶黄素药理研究的深入,发现叶黄素在保护视觉、预防白内障、防治动脉硬化、增强免疫力等方面起着重要作用。因此,美国FDA1995年将叶黄素列入食品补充剂名单。

万寿菊是富含叶黄素类物质的天然原料[5],目前叶黄素的提取原料主要为万寿菊。近年来国外对于叶黄素提取的研究发展很快,我国对万寿菊色素研究开发得较少,尤其是对高纯度叶黄素的研究开发。目前,国内提取叶黄素的大多数厂家采用的工艺是:应用正己烷、石油醚[6]、食用油脂或者四氢呋喃和乙醇的混合溶剂为提取溶剂先从万寿菊中提取出叶黄素酯,再加入金属强碱使叶黄素直链脂肪酸酯皂化,形成游离叶黄素[7]。其步骤较繁琐、溶剂消耗较多、成本较高。本研究采用四氢呋喃、乙醇和金属碱液的三元混合溶剂为主要提取剂,使提取、皂化同步进行,与文献报道的传统工艺:正己烷和95%乙醇(体积比3∶2),提取温度60 ℃,提取时间4～5h。提取次数5～6次,液料比15∶1(mL∶g);皂化温度55～60℃,皂化时间6 h[6],相比之下本实验可节约试剂和减少能源损耗,并对提取皂化工艺进行优化,提高产品得率,使该工艺更适合于工业生产。

1 材料与方法

1.1 材料

万寿菊颗粒,由新疆石河子市农五师八十四团万寿菊加工厂提供。叶黄素对照品(含量≥95%),购买于上海融禾医药科技有限公司。

1.2 试剂

四氢呋喃(THF)、乙醇、乙酸乙酯等,均为分析纯;乙腈、甲醇,均为色谱纯。

1.3 主要仪器设备

岛津高效液相色谱仪(SIL-20A自动进样器,SPD-M20A型光电二极管阵列检测器,CTO-10ASVP柱温箱,LC-20AT二元泵,DGU-20A5真空脱气机 ,日本岛津);HJ-6A多头磁力搅拌器(山东菏泽市祥龙电子科技有限公司);SEMCO-R206型旋转蒸发器(上海申生科技有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)。

1.4 方法

1.4.1 叶黄素的HPLC检测[8-9]

色谱条件:色谱柱为 Waters C18(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱;流动相为甲醇∶乙腈(40∶60),流速为1 mL/min,柱温为30 ℃,检测波长为446 nm;进样体积为10μL。

对照品母液的配制:精密称取2.24 mg叶黄素对照品用乙腈溶解,定容至25 mL容量瓶中,制得浓度为89.6μg/mL的叶黄素标准液。

标准曲线的绘制:分别准确移取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL上述对照品母液至10 mL容量瓶中,用乙腈定容至刻度,用0.22μm微孔滤膜过滤后。按叶黄素的 HPLC测定方法,以叶黄素峰面积为纵坐标(Y),溶液浓度(μg/mL)为横坐标(X),绘制标准曲线,其方程为 Y=63483.86X-337.72,R2=1.000,线性范围:8.96～44.8μg/mL。

1.4.2 游离叶黄素样品的制备

取万寿菊颗粒,粉碎,过60目筛,称取适量过筛后粉末置于圆底烧瓶,加入一定量的 THF、乙醇(95%)、KOH溶液,在一定温度下,反应一段时间后,过滤、滤液用2.5 moL/L HCl调节p H至中性、蒸干滤液、乙酸乙酯溶解蒸干产物转移至100 mL容量瓶定容,精密移取2.00 mL溶液,用乙腈定容至10 mL棕色容量瓶中,测定。注意尽量避光。

1.4.3 单因素考察及正交试验

按“1.4.2”项下方法,分别对不同的 THF/乙醇的比例、反应时间、料液比、加水体积、加碱量、反应温度进行单因素考察实验,在此基础上选取影响较大四个因素采用L9(34)正交试验考察对叶黄素得率的影响,最终得到提取皂化最优工艺。

1.4.4 叶黄素得率的计算

根据 HPLC测得的叶黄素含量,计算提取叶黄素质量,再由式1计算叶黄素得率。

2 结果与讨论

2.1 单因素考察

2.1.1 THF/乙醇比例的考察

取万寿菊颗粒,按“1.4.2”方法加入不同比例的THF、乙醇(95%),以叶黄素峰面积为指标,考察THF/乙醇比例对实验的影响。试验结果如图1所示。

由图1可知:THF/乙醇的比例对提取皂化的影响较大,在7∶3～0∶10范围内时,叶黄素峰面积呈现抛物线趋势,最高得率为0.53%。

图1 不同比例的THF/乙醇对提取皂化效果的影响Fig.1 Different ratios of THF/ethanol on the Influences of Extraction rate

2.1.2 反应时间的考察

按“1.4.2”方法选择不同提取皂化时间制备样品,以叶黄素峰面积为指标,考察时间对实验的影响,试验结果如图2所示。

由图2可知:提取皂化时间对产物中游离叶黄素的含量变化有较大的影响。随着皂化时间的延长,产品中游离叶黄素的含量首先不断增加,当超过4 h后影响不显著,说明反应已基本达到平衡,最高得率为0.80%。

图2 不同反应时间对提取皂化效果的影响Fig.2 Different time on the Influences of Extraction rate

2.1.3 料液比的考察

取万寿菊颗粒,按“1.4.2”方法按不同的料液比制备样品,以叶黄素峰面积为指标,考察料液比对实验的影响,试验结果如图3所示。

由图3可知:当液料比在1∶10～1∶40范围内,随着皂化液体积的增加,产品中游离叶黄素的含量逐渐升高,当料液比超过1∶40后,叶黄素峰面积基本保持平衡,最高得率为0.93%。考虑到四氢呋喃易燃且对皮肤、眼睛和呼吸器官有刺激性,使用过多溶剂浪费大,且给溶剂回收带来困难,因而液料比不应低于1∶40。

图3 不同料液比对提取皂化效果的影响Fig.3 Different Liquid to material ratio on the Influences of Extraction rate

2.1.4 加水体积的考察

取万寿菊颗粒,按“1.4.2”方法。加入相同质量的KOH于不同体积的蒸馏水中制备样品,以叶黄素峰面积为指标,考察加水体积对实验的影响,试验结果如图4所示。

图4 不同加水体积对提取皂化效果的影响Fig.4 Different volumes of water on the Influences of Extraction rate

由图4可知:当水与 THF-乙醇混合溶液的比例在1∶2～1∶20范围内,随着皂化液体积的增加,产品中游离叶黄素的含量逐渐升高,当其超过1∶20后,叶黄素峰面积略有下降,最高得率为1.13%,所以选择该比例为1∶20较为适宜。

2.1.5 加碱量的考察

取万寿菊颗粒,按“1.4.2”方法加入不同质量的 KOH于相同体积的蒸馏水中制备样品,以叶黄素峰面积为指标,考察因素对实验的影响,试验结果如图5所示。

由图5可知:随着加碱量的增加,提取得到的叶黄素也呈上升趋势,当溶液达到饱和时,叶黄素得率为1.14%。但是考虑到饱和的KOH溶液耗碱量较大,成本较高,故加碱量需进一步优化。

图5 不同加碱质量对提取皂化效果的影响Fig.5 Different quality of KOH on the Influences of Extraction rate

2.1.6 提取皂化温度的考察

取万寿菊颗粒,按“1.4.2”方法在不同温度的恒温水浴下提取皂化2 h,制备样品。以叶黄素峰面积为指标,考察温度对实验的影响,试验结果如图6所示。

图6 不同温度对提取皂化效果的影响Fig.6 Different temperature on the Influences of Extraction rate

由图6可知:温度在40℃时,叶黄素峰面积最大,其得率为0.94%。这是由于较低的温度不利于叶黄素酯在皂化体系中分散,而皂化温度过高则会导致叶黄素的分解,并且 THF和乙醇都易挥发。因此,皂化温度控制在40℃为宜。

2.2 正交试验

在单因素试验的基础上,在上述单因素中选取对提取皂化效果有显著性影响的四个因素,即 THF与乙醇的比例、料液比、加碱量、反应时间,采用正交试验法进一步考察各因素对提取皂化效果的影响。选择3个水平,以产品中游离叶黄素得率为考核指标,采用L9(34)正交表(表 1)进行试验,结果见表2,方差分析结果见表3。

由表2的极差值R和表3的方差分析结果可以看出,4种因素对叶黄素得率的影响程度依次为时间＞加碱质量＞THF∶乙醇＞料液比,最佳工艺条件为A1B2C2D3,即料液比为1∶20,加碱质量1.6 g,反应时间4 h,THF∶乙醇=2∶8。

表1 提取皂化工艺因素水平Tab.1 Levels and facts

表3 方差分析Tab.3 Variance analysis

2.3 验证试验

取万寿菊颗粒,按“1.4.2”方法和正交试验的最佳工艺提取皂化3次,计算得到平均叶黄素得率为1.14%。所得浸膏中,平均叶黄素的含量达到10.32%,RSD为2.05%。

3 讨论

1)由万寿菊颗粒提取皂化工艺合理,研究确定最优工艺参数为:料液比为1∶20,加碱质量1.6 g,反应时间4 h,THF∶乙醇=2∶8。

2)传统工艺所得浸膏中叶黄素含量为2%～7%[6,10],而在本实验条件下得到浸膏中游离叶黄素的含量达到10.32%,叶黄素得率为1.14%。

3)本实验采用混合溶剂将叶黄素的提取实验和皂化实验同步进行,减少了操作步骤,降低损耗,节约成本,适合于大规模工业化生产。

4)叶黄素的稳定性受诸多因素影响,对光、热、氧敏感,极易被氧化,实验操作过程中应尽量避免光照、高温,隔绝氧气。

[1]刘洪海,杜平,梁红兵,等.万寿菊花中叶黄素酯的提取及皂化工艺的研究[J].农产品加工,2009,(3):71-74,77.

[2]李高峰,聂永亮,王佩维.叶黄素浸膏的皂化工艺研究[J].食品科技,2009,(08):172-176.

[3]赵小阳,田河山.叶黄素的测定方法研究[J].饲料广角,2007,(21):40-42.

[4]Sowbhagya HBSAR,Krishnamurthy N.Natural colorant from marigold chemistry and technology[J].Food and Reviews International,2004,20(1):33-50.

[5]李高峰,聂永亮,王佩维.万寿菊花萃取物中叶黄素的分离与纯化[J].时珍国医国药,2009,20(7):1688-1689.

[6]秦清.万寿菊花中叶黄素提取及分离提纯的研究[J].林产化学与工业,2008,28(1):55-58.

[7]张伟,唐晓丹,张静.万寿菊提取物中高纯度叶黄素反应条件的研究[J].特产研究,2009,31(3):40-42.

[8]赵珺彦,邱新文,翟鹏贵,等.高效液相色谱法测定血清中的叶黄素[J].现代中西医结合杂志,2008,17(7):1025-1026.

[9]李高峰,王佩维,聂永亮,等.高效液相色谱法测定万寿菊花萃取物中的叶黄素含量[J].时珍国医国药,2009,20(4):883-884.

[10]崔震海,孙海蛟,高翠玲,等.万寿菊叶黄素提取工艺的研究[J].辽宁化工,2008,37(4):234-235,238.

Extraction and Saponification Technology of Lutein from Marigold

ZHAO Jie,YIN Juntao,GUO Yake,LI Chaopeng,CHEN Wen
(Department of Pharmacy,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

In this paper,Extraction and Saponification technology of Lutein esters inTagetes erectaL.particle were investigated systemically.The mixed solvent of THF and Alc is main extraction solvent.The affecting factors such as the ratio of THF and Alc,reaction time,the ratio of reaction solution to material(mL/g),the addition of water,the addition of KOH in reaction solution and reaction temperature were investigate in singe factor experiments.An orthogonal test table L9(34)was used to optimized the affecting factors on the base of singe factor experiments.The content of free Lutein in the end product was determined by HPLC.The results showed that the optimal Extraction and Saponification parameter was:1.6g KOH,4h,the ratio of 1∶20(mL/g),ratio of THF and Alc is 2∶8.Under this condition,the yield of Free Lutein reach 1.14%and the content of Free Lutein reach 10.32%in extracta sicca.

Marigold;lutein;extraction and saponification;orthogonal test

R97 < class="emphasis_bold">文献标识码:A

A

2010-07-08

新疆兵团工业科技攻关项目(2009GG35),科技部科技人员服务企业行动项目(SQ2009G J G4102765)

赵洁(1985-),女,硕士生,专业方向为药物新剂型的研究。

陈文(1967-),男,教授,从事药物新剂型的研究;e-mail:chen-wen2000@126.com。