单关节类风湿性关节炎滑膜组织中uPA、uPAR、PAI-1蛋白表达及意义

孙建华,李子恢,史晨辉,潘晓琳,陈磊,王永明,李林,李宽新

(1石河子大学医学院第一附属医院,石河子832002;2石河子市人民医院,石河子832000)

单关节类风湿性关节炎滑膜组织中uPA、uPAR、PAI-1蛋白表达及意义

孙建华1,李子恢2,史晨辉1,潘晓琳1,陈磊1,王永明1,李林1,李宽新1

(1石河子大学医学院第一附属医院,石河子832002;2石河子市人民医院,石河子832000)

为探讨尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,uPA)及其受体(urokinase-type plasminogen activator receptor,uPAR)、纤溶酶原激活物抑制剂(plasminogen activator inhibitor,PAI-1)在单关节发病类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的表达。采用免疫组化方法检测13例单关节发病RA、19例典型RA和20例正常滑膜组织中uPA、u PAR、PAI-1蛋白表达情况。结果显示:13例单关节 RA滑膜组织中 uPA、u PAR、PAI-1阳性表达主要分布在滑膜衬里细胞、滑膜下层单核细胞及血管内皮细胞,阳性表达部位与典型RA相同,但表达强度明显低于典型RA(P＜0.05)。与正常滑膜组织相比,单关节 RA滑膜中uPA、uPAR、PAI-1蛋白表达明显增高(P＜0.05)。由此可知:单关节RA滑膜组织中uPA、uPAR、PAI-1表达明显低于典型 RA滑膜组织,可能与单关节RA为典型RA病程早期阶段,滑膜中uPA、uPAR、PAI-1蛋白尚处于低水平表达阶段有关。

关节炎;类风湿;尿激酶;免疫组织化学

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性进行性全身结缔组织疾病,其病理特征是滑膜细胞高度增生并伴有大量的淋巴细胞浸润。过度增殖的滑膜细胞分泌大量蛋白裂解酶,造成关节软骨及骨破坏。其中丝氨酸蛋白酶家族中的尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen ac-tivator,uPA)在软骨及骨基质的降解中发挥着重要作用。

大量研究表明,RA滑膜中uPA及其受体蛋白(urokinase-type plasminogen activator receptor,u PAR)表达明显高于其他炎症性关节[1]。但有关uPA、uPAR及纤溶酶原抑制剂(plasminogen activator inhibitor,PAI-1)在单关节RA滑膜组织中表达,尚未见报道。我们选择本院于1998年9月至2006年5月,单关节RA患者13例,采用免疫组织化学,检测滑膜组织中 uPA、uPAR、PAI-1的分布及表达,报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料

单膝关节 RA13例,男 7例,女5例,年龄12～70岁,平均年龄34.6岁。全部以单膝关节滑膜炎就诊,其中左膝8例,右膝5例。关节镜检结合滑膜病检符合 RA。随访3～11年,平均6.9年,随访过程中出现多关节发病,符合美国风湿病协会(ARA)1987年诊断标准,确诊为RA。另取典型RA19例滑膜标本作为阳性对照组。正常20例滑膜组织,均取自无关节病变的膝关节外伤患者。

1.2 标本分组

A组:单关节 RA13例;B组:典型 RA19例;C组:正常滑膜20例。

1.3 组织学检测

常规苏木素、伊红(HE)染色。

1.4 免疫组化检测

主要试剂为 SP试剂盒(武汉博士德公司),抗uPA、uPAR、PAI-1单克隆抗体,工作浓度分别为1∶100、1∶150、1∶150,DAB 显色液浓度为 0.04%。采用SP免疫组织化学技术:石蜡切片常规脱蜡,10%的正常羊血清室温封闭20 min,依次加入一抗,生物素标记二抗,辣根过氧化物酶标记的 SP,DAB-H2O2显色溶液,苏木素复染,中性树脂封片,每个步骤间用 PBS冲洗3次,每次5 min,显微镜下观察结果。

1.5 结果判断

1)细胞质和(或)细胞膜中出现明显的棕色或棕黄色颗粒为uPA、uPAR、PAI蛋白阳性细胞。

2)参照 Szekanecz等[2-3]方法:400倍高倍镜视野下滑膜组织中的阳性细胞占全部细胞的比例分为:阴性(-):阳性细胞数＜10%;阳性(+):阳性细胞占10%～40%;阳性(++):40%～70%;阳性(+++)＞70%。其中染色阳性包括(+)、(++)和(+++),强阳性包括(++)和(+++)。

1.6 统计学处理

应用 SPSS 10.0软件包,采用两样本构成比(率)比较的χ2检验。P＜0.05:差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HE结果

由图1可知:A组滑膜衬里层细胞明显增生,部分滑膜增生形成绒毛。大量淋巴细胞浸润,部分有淋巴小结形成。由图2可知:B组:镜下 HE结构同A组。C组:滑膜表面为3层衬里层细胞,无明显增生及炎性细胞浸润。

图1 类风湿关节炎滑膜组织HE染色Fig.1 Rheumatoid artenitis synorium tissue

图2正常滑膜组织HE染色Fig.2 Normal synovium tissue

2.2 免疫组织化学结果

uPA、uPAR、PAI-1蛋白阳性细胞主要分布在滑膜衬里层和滑膜下层,其中滑膜衬里细胞、单核细胞和部分浆细胞细胞质中呈阳性染色,滑膜下层的小血管内皮细胞亦呈阳性染色。各组抗原阳性表达结果见表1。

表1 各组滑膜组织uPA、u PAR、PAI-1的表达Tab.1 Expnession of various synovium tissues such as uPA、u PAR、PAI-1

2.3 uPA、uPAR、PAI-1蛋白阳性结果比较

结果见表2。由表2可知:A组与B组相比,3种蛋白阳性表达数差异无统计学意义(P＞0.05),强阳性表达数差异具有统计学意义(P＜0.05);A组与C组相比,3种蛋白阳性表达数差异具有统计学意义(P＜0.05),uPA强阳性表达数差异具有统计学意义(P＜0.05),而 uPAR、PAI-1蛋白强阳性表达数差异无统计学意义(P＞0.05)。此外,本实验还观察到凡在 uPA表达阳性的病例,uPAR、PAI-1蛋白多呈阳性,但表达强度稍低于uPA组。

表2 各组滑膜组织中uPA、u PAR、PAI-1蛋白阳性率比较Tab.2 Comparision of protein positiuty rates in various syrovium tissues such as uPA、u PAR、PAI-1

3 讨论

1)RA是一种慢性进行性结缔组织病变,侵犯全身多个关节,滑膜组织最先受累。其基本病理学特征是滑膜组织增生,伴有大量淋巴细胞浸润及血管翳形成。过度增殖的滑膜细胞分泌大量的蛋白裂解酶,对软骨及骨基质的降解起着关键作用。参与基质降解过程的蛋白裂解酶有4类,目前研究最多的为丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)。

uPA属于丝氨酸蛋白酶家族,主要介导细胞周围基质蛋白的降解,从而直接降解细胞外基质及基底膜[4],同时可以激活其他蛋白酶,协同参与软骨及骨基质降解过程。研究发现,uPA在RA、骨性关节炎(osteroarthritis,OA)等炎症性关节病的软骨、滑膜、滑液及血浆中均有表达。uPA、uPAR、PAI-1蛋白在RA滑膜组织中表达明显高于正常人及OA滑膜组织[4]。

本文19例RA滑膜标本免疫组化染色结果提示:uPA、uPAR、PAI-1蛋白阳性表达明显高于正常组,表达强度明显高于单关节RA组,结果与文献报道一致。RA滑膜中 uPA、uPAR、PAI-1蛋白强阳性表达,可能与RA类似于局限侵袭性生长的肿瘤有关。本研究同时发现,RA滑膜组织中 uPA、uPAR、PAI-1蛋白具有良好的协同性。在uPA表达阳性的病例中、uPAR及PAI-1多呈阳性表达,这说明在uPA系统介导的纤溶降解过程中,uPA与uPAR具有相互促进的作用,以适应其蛋白溶解活动的需要。而PAI-1与uPA的协同增高,可能与细胞膜表面的uPAR上调有关,以适应同时表达增强的uPA与uPAR。

2)uPA通常是以无活性的单链形式从细胞中释放出来,再转变成有活性的双链分子。研究证实RA病变滑膜组织中的滑膜细胞、血管内皮细胞、炎性浸润细胞和关节软骨细胞均能表达uPA、uPAR等多种成分[5]。且RA患者滑液中uPA、uPAR抗原活性的增高程度与临床上RA的病情活动性和软骨及骨破坏的放射线表现密切相关[6]。

单关节 RA病变仅累及一个关节,它是典型RA的初始阶段,还是应用非甾体类药物而使病变局限,值得进一步研究。

有关uPA、uPAR、PAI-1在单关节 RA滑膜表达,尚未见报道。我们选择13例以单关节发病,关节镜检结合病理检查符合 RA,随访中确诊 RA,检测其滑膜中uPA、uPAR、PAI-1蛋白表达。研究结果表明,组织学上单关节RA滑膜组织与典型RA无明显区别,表现为滑膜组织增生及大量淋巴细胞浸润,部分病例可见淋巴小结形成。92%滑膜组织中表达uPA、uPAR蛋白,77%表达PAI-1蛋白。阳性细胞主要为滑膜衬里层细胞、滑膜下层单核细胞及血管内皮细胞,阳性细胞表达部位与典型RA滑膜相似。单关节RA滑膜组织中uPA、uPAR、PAI-1蛋白阳性表达与RA组相比差异无显著性,较正常滑膜明显增高,但表达强度明显低于典型 RA。这可能与单关节RA为典型RA的早期阶段,病情活动相对局限,滑膜组织中 uPA、uPAR、PAI-1抗原尚处于低水平表达阶段有关。

[1]郭晓兰.尿激酶型纤溶酶原激物受体及炎性关节病[J].国外医学内科学分册,2005,32(3):123-129.

[2]Szekanecz Z,Haines G K,Koch A E.Differential expression of the urokinase receptor(CD87)in arthritic and normal synovial tissue[J].J Clin Pathol,1997,50:314-319.

[3]李宽新,王鑫,史晨辉.骨关节炎滑膜组织中 uPA、uPAR、PAI-1表达及意义[J].石河子大学学报:自然科学版,2008,26(6):728-731.

[4]何斌,史晨辉,王永明。尿激酶型纤溶酶原激物系统与软骨降解[J].农垦医学,2005,27(3):229-231.

[5]Guidueci S,Del Rosso A,Cinelli M,et al.Rheumatoid synovial fibmblasts constitutively express the fibrinolytic pattern of inva-sive tumor-like cells[J].Clin Exp Rheumatol,2005,23:364-372.

[6]周京国,郭晓兰,唐中,等.可溶性尿激酶型纤溶酶原激物受体在 RA患者血浆和滑液的水平及其临床意义[J].中华风湿学杂志,2006,10(12):713-716.

Expression of Urokinase Type Plasminogen Activator and its Receptor and Plasminogen Activator Inhibitor in Rheumatoid Arthritis with Solitary Joint

SUN Jianhua1,LI Zihui2,SHI Chenhui1,PAN Xiaolin1,CHEN Lei1,WANG Yongming1,LI Lin1,LI Kuanxin1
(1 The First Affiliated Hospital of Shihezi University,Shihezi 832002,China;;2 The Ren Min Hospital of Shihezi City,Shihezi 83000,China)

To study the expression of urokinase-type plasminogen activator(uPA),its receptor(uPAR)and plasminogen activator inhibitor(PAI-1)in synovial tissues of rheumatoid arthritis with solitary joint.Immuneohistochemical analysis was used in synovial tissues from 13 patients with RA in solitary joint,19 patients with RA and 20 from normal synovial tissues.For 13 patients with RA in solitary joint,Positive expression of uPA,uPAR and PAI-1proteins were found in synovial lining cells,mononuclear cells and endothelial cells.The sites of positive expression of uPA,uPAR and PAI-1 proteins were similar to RA(P＜0.05).But its positive rate was significantly higher compare with the normal synovial tissues(P＜0.05).There were low expressions of uPA,uPAR and PAI-1 proteins in RA with solitary joint synovial tissues,which indicated that RA with solitary joint might occur at the early stages of RA.So the expressions of uPA,uPAR and PAI-1 in RA with solitary joint synovial tissues were at the stages of low expression.

arthritis;rheumatoid;urokinase;immunohistochemistry

R36 < class="emphasis_bold">文献标识码:A

A

2010-03-20

孙建华(1972-),男,副主任医师,从事骨科学研究。