中国美利奴羊PRLR基因外显子10 SSCP多态性与部分繁殖性状的关联分析

吴洪宾,吴荷群,王遵宝,余鹏,赵宗胜,张文祥

(1石河子大学动物科技学院,石河子832003;2新疆兵团农六师五家渠市畜牧兽医工作站,五家渠831300;3石河子大学生命科学学院,石河子832003)

中国美利奴羊PRLR基因外显子10 SSCP多态性与部分繁殖性状的关联分析

吴洪宾1,吴荷群2,王遵宝1,余鹏3,赵宗胜1,张文祥1

(1石河子大学动物科技学院,石河子832003;2新疆兵团农六师五家渠市畜牧兽医工作站,五家渠831300;3石河子大学生命科学学院,石河子832003)

以催乳素受体基因(PRLR)作为绵羊繁殖性状的候选基因,运用PCR-SSCP方法对PRLR外显子10的多态性进行检测,并对其多态性与绵羊部分繁殖性状进行了关联分析。结果表明:在PRLR外显子10的2个基因片段存在PCR-SSCP多态,PRLR1扩增片段存在3种基因型,PRLR2扩增片段存在4种基因型;Hardy-Weinberg平衡检验显示,中国美利奴羊群体在2个位点都处于平衡状态;CE和DD基因型中国美利奴羊产羔数均值比CD和DE型多0.31只(P＜0.05);AA基因型中国美利奴羊初生重均值比BB型重0.66 kg(P＜0.05);DE基因型中国美利奴羊3月龄重均值比CD型重2.42 kg(P＜0.05)。

绵羊;PRLR;繁殖性状;PCR-SSCP

生产实践表明,绝大多数绵羊属季节性发情,其生产周期长,繁殖力低,极大地限制了养羊业的发展。家畜的繁殖性状是受多基因控制、遗传力低的数量性状[1],采用常规的表型选育法提高绵羊繁殖力不仅耗时长,而且很难获得较大的进展。

催乳素(Pro-lactin,PRL)是由腺垂体催乳素细胞合成和分泌的一种肽类激素,主要作用于动物的性腺和乳腺。催乳素与其受体(pro-lactin receptor,PRLR)结合后作用于靶细胞,调节繁殖相关激素的分泌[2-3]。因此,国内外许多遗传学者将PRLR基因作为影响哺乳动物繁殖的候选基因,研究其对动物繁殖性能的影响。PRLR是细胞因子受体超家族的一员,其总长度约为100 kb,有10个外显子和9个内含子组成[4]。PRLR基因是生长与分化的一个重要调控基因,猪黄体细胞中PRLR数目在妊娠期间增加。王吉振等[5]、牟玉莲等[6]将PRLR作为绵羊高繁殖率的候选基因,对其内含子2多态性进行了研究,发现其多态性与小尾寒羊的产羔数有关。利用携带高繁殖力主效等位基因的绵羊个体进行杂交,根据分子标记进行辅助育种,就可以培育高产的绵羊品系,所以确定绵羊高繁殖力的主效基因至关重要[7]。

本研究根据 PRLR基因外显子10序列,采用Primer 5.0软件设计了2对引物,探讨了 PRLR基因外显子10在中国美利奴羊群中的PCR-SSCP多态性分布,并分析了基因位点与部分繁殖性状的关联性,旨在寻找繁殖性状相关的分子标记,为绵羊育种进行标记辅助选择提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选择新疆兵团农九师165团中国美利奴羊(新疆军垦型)135只,颈静脉采血,用ACD抗凝,-20℃冻存。用酚氯仿抽提法提取基因组DNA,溶于超纯水中,4℃保存。

1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、dNTP均购自北京天根公司;PUC19 DNA/MspⅠ(HpaⅢ)Marker、丙烯酰胺(acrylamide)、甲叉双丙烯酰胺(bis-acrylamide)、过硫酸铵(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)、琼脂糖(Agrose)均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。冰乙酸,硝酸银,甲醛,溴酚蓝等试剂均为国产分析纯。

1.3 PCR扩增

根据 GenBank上牛的PRLR基因外显子10序列(GenBank登录号为NC_007318)上设计的2对引物(表1),由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

PCR反应体系(25μL):buffer(含 5μmol/L Mg2+)2.5μL,2.5μmol/L dNTPs 2μL,10 μmol/L上、下游引物各1μL,模板DNA 50 ng,5 U/μL Taq DNA 聚合酶 0.6μL,补超纯水至 25 μL。PCR反应条件:预变性95℃5 min,然后变性94 ℃30 s,复性30 s,延伸72 ℃20 s,35个循环,最后延伸10 min。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测,UVP凝胶成像系统照相保存。

表1 PRLR基因引物信息Tab.1 Primers of PRLR gene

1.4 SSCP分析

取5μL PCR产物和5μL变性剂(98%甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯氰、10 mmol/L EDTA(p H 8.0)、10%甘油)混匀,98 ℃变性 10 min,迅速冰浴5 min。

变性后的PCR产物在10%非变性聚丙烯酰胺凝胶中175 V电泳17 h,电泳结束后,银染显带。将染好的凝胶置于凝胶系统,拍照成像并保存。

1.5 克隆测序

SSCP分析后,选取不同基因型的PCR产物运用DNA片段快速纯化回收试剂盒纯化,纯化后的DNA片段用 PM18-T载体连接,并转化至大肠杆菌TOP10菌株,PCR鉴定后送样测序。测序反应由北京华大基因科技公司完成。

1.6 数据统计

计算各位点的基因频率和基因型频率,并进行Hardy-Weinberg平衡卡方适合性检验;计算多态信息含量(PIC)、有效等位基因数(Ne)和群体杂合度(He),并采用SPSS 13.0软件的 GLM分析基因型效应与双胎性状、羔羊初生重、3月龄重的关联性。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

PRLR基因外显子10部分PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果见图1。

通过克隆测序证实该扩增片段就是目的片段,且特异性好,可用于SSCP分析。

图1 2对引物的PCR产物Fig.1 PCR products of 2 pairs of primers

2.2 SSCP分析

中国美利奴羊PRLR1和PRLR2扩增的 PCR产物SSCP分析结果表明:引物 PRLR1(图2)和PRLR2(图 3)扩增片段存在单核苷酸多态性。PRLR1扩增片段有3种基因型,分别定义为AA、AB和BB;PRLR2扩增片段有4种基因型,分别定义为 CD、CE、DD和DE。

2.3 序列分析

取AA、AB、BB 3种基因型的PCR产物进行克隆和测序。与原序列相比,结果(图4)显示:AA型第53bp有一处A-G的突变,BB型与原序列相同,AB型第53bp有一处A-G的突变、在81 bp处发生G-A的突变,但3个突变均未引起氨基酸的改变,为沉默突变。

取CD、CE、DD和DE 4种基因型的 PCR产物进行克隆和测序。与原序列相比,结果(图5、图6)显示:DD型与原序列相同;DE型在该片段第146处发生C-G的突变,此突变导致丙氨酸变为甘氨酸(Ala-Gly);CD型在第132 bp处发生 G-A的突变,未引起氨基酸的改变,为沉默突变,CE型还在第132 bp处发生了 G-A的突变,在第167处发生C-T的突变,导致脯氨酸变为亮氨酸(Pro-Leu)。

图2 PRLR1扩增片段的SSCP分析Fig.2 SSCP analysis of PCR amplification using PRLR1

图3 PRLR2扩增片段的SSCP分析Fig.3 SSCP analysis of PCR amplification using PRLR2

图4 绵羊 PRLR1中AA、AB、BB型的DNA序列比较Fig.4 Nucleotide Sequences comparison of AA,AB and BB genotypes of PRLR1 in sheep

图5 绵羊PRLR2中DD、DE、CD和CE型的DNA序列比较Fig.5 Nucleotide Sequences comparison of DD,DE,CD and CE genotypes of PRLR2 in sheep

图6 绵羊 PRLR2中DD、DE、CD和CE型的氨基酸序列比较Fig.6 Amino acid sequences comparison of DD,DE,CD and CE genotypes of PRLR2 in sheep

2.4 PRLR基因在中国美利奴羊中的遗传多态性

由表2可见,中国美利奴羊群体中在 PRLR1位点上AA基因型频率最高,BB型最低;在PRLR2位点上DD基因型频率最高,CE型最低。基因座位在群体中的多态信息含量、群体杂合度、有效等位基因数及卡方检验见表3。从表3可以看出,两位点的多态信息含量分别为0.3318和 0.3397,处于0.25和0.50之间,表明两位点在中国美利奴羊群体中处于中度多态。χ2适合性检验结果(表3)表明,中国美利奴羊在 PRLR1、PRLR2位点上处于Hardy-Weinberg 平 衡状态,(χ2=0.1538,P=0.6949;χ2=4.338,P=0.227)。

表2 中国美利奴羊中PRLR基因的等位基因频率和基因型频率Tab.2 The genotype frequency and gene frequency of PRLR gene in China Merino

表3 基因座位在群体中的多态信息含量、杂合度、有效等位基因数及卡方检验Tab.3 Data of H,Ne,PIC andχ2-test

2.5 PRLR基因多态性与中国美利奴羊部分繁殖性状之间的关联分析

不同PRLR基因型与中国美利奴羊的产羔数、初生重和3月龄重的一般线性分析结果见表4。

表4 PRLR1、PRLR2基因型与繁殖性状的相关分析Tab.4 Correlation analysis between different genotypes of PRLR

由表4可见,PRLR1位点的AA基因型中国美利奴羊初生重比BB型重0.664 kg(P＜0.05);3种基因型之间产羔数和3月龄重均值差异都不显著(P＞0.05);PRLR2位点的DE基因型的3月龄重比其他3种基因型重1.7 kg左右(P＜0.05);CE基因型产羔数比CD基因型多0.31只(P＜0.05),比DE基因型多0.3只(P＜0.05);DD基因型产羔数比CD基因型多0.32只(P＜0.05),比DE基因型多0.31只(P＜0.05),即CE和DD基因型比CD和DE基因更易产生双胎。

3 讨论

本研究分析了PRLR基因外显子10上2个位点的遗传特性,对个基因型效应与中国美利奴羊部分繁殖性状进行关联分析,发现两位点突变率较高,哈代温伯格检验结果显示两位点均处于平衡状态,后经关联分析发现基因型在中国美利奴羊部分繁殖性状上分部差异显著,这表明基因型对中国美利奴羊部分繁殖性状有较大影响。据此我们推测PRLR基因可能是影响中国美利奴羊部分繁殖性状的基因。

国内外对PRLR基因在动物繁殖性状上的影响研究较多。Linville等[8]研究了 PRLR基因对猪第一胎窝产仔数和排卵数的影响,结果表明,在不同品系猪中PRLR基因频率的分布不同(P＜0.05),低频率等位基因A与较高的排卵数、较高的总产仔数、较高的活产仔数、较低的木乃伊率有关。Rothschild等[9]报道了相对保守的 PRLR基因的1个氨基酸残基变化与猪高窝产仔数相关联。Ormandy等[10]通过大鼠胚胎干细胞的基因定位得知其携带着PRLR的种系无效突变基因,该基因对繁殖性状有很大的影响。王吉振等[5]将其作为绵羊高繁殖率的候选基因,对PRLR内含子II的多态性与小尾寒羊、陶赛特和萨福克产羔数之间的关系进行了分析,发现在扩增片段第84和174 bp处分别存在1个T-C和 T-G的突变,纯合子基因型的小尾寒羊平均产羔数比野生型增加0.64只。银晶[11]对济宁青山羊等5个品种PRLR内含子II多态性进行了研究,分别在第35和86 bp处发生了C-A和A-G突变,突变纯合子的济宁青山羊产羔数比突变杂合子型多0.66只(P＜0.01)。牟玉莲等[6]首次对小尾寒羊、萨福克、陶赛特羊等绵羊品种 PRLR外显子10的多态性进行了研究,结果发现在该区域存在多态性,但没有报道突变的位置和类型。李广录等[7]在湖羊、中国美利奴和罗米丽的 PRLR外显子10中共发现6个点突变,然而突变是否影响绵羊的产羔数,文中并未报道。以上研究结果表明,PRLR可以作为绵羊产羔数的分子标记位点,用于高繁殖率绵羊个体的选育。

本研究采用 PCR-SSCP技术对绵羊 PRLR基因外显子10部分核苷酸多态性及其与中国美利奴羊间的关系进行了分析,结果发现:AA型第53 bp有一处A-G的突变,AB型第53 bp和81 bp分别有A-G和 G-A的突变,但3个突变均未引起氨基酸的改变,为沉默突变;DE型在该片段第146处发生CG的突变,此突变导致丙氨酸变为甘氨酸(Ala-Gly);CD型在第132 bp处发生 G-A的突变,未引起氨基酸的改变,为沉默突变,CE型还在第132 bp处发生了 G-A的突变,在第167处发生C-T的突变,导致脯氨酸变为亮氨酸。在 PRLR1位点,对于初生重的影响AA基因型与BB型差异显著(P＜0.05),总体趋势AA＞AB＞BB;3种基因型之间的产羔数和3月龄重均值差异都不显著(P＞0.05)。在PRLR2位点,对于绵羊3月龄重的影响DE基因型明显高于其他3种基因型(P＜0.05);CE和DD基因型产羔数没有明显的差异,但明显高于CD和DE基因型(P＜0.05),即CE和DD基因型比 CD和DE基因更易产生双胎。根据上述结果可初步认为PRLR基因可能是控制中国美利奴羊繁殖性能的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个标记。

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Relationship between Polymorphism of Exon 10 of Prolactin Receptor Gene and Reproduction Trait of Chinese Merion Sheep

WU Hongbin1,WU Hequn2,WANG Zunbao1,YU Peng3,ZHAO Zongsheng1,ZHANG Wenxiang1
(1 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Animal Husbandry and Veterinary Station at Agricultural Construction Division 6 in Xinjiang,Wujiaqu 831300,China;3 College of Life Science,Shihezi Univesity,Shihezi 832003,China)

This study selected prolactin receptor(PRLR)as the candidate gene of sheep reprodution trait,detected the polymorphism of exon 10 of prolactin receptor gene and analyzed the relationship between polymorphism of exon 10 of PRLR between reproduction trait of sheep.The result showed that there were two transitions in exon 10 of sheep PRLR gene,which were three genetypes of PRLR1 and four genetypes of PRLP2;both of the two sites accorded with Hardy Weinberg equilibrium in Chinese Merino sheep.The correlation analysis showed that the Chinese Merino sheep with genotype CE and DD had 0.31(P＜0.05)lambs more than those with genotype CD or DE;the average birth weight of genetype AA was 0.66 kg heavier than genetype BB(P＜0.05);the average three-month weight of genetype DE was 2.42 kg heavier than genetype CD(P＜0.05).

sheep;PRLR;reproduction trait;PCR-SSCP

S827.2;Q959.842 < class="emphasis_bold">文献标识码:A

A

2010-05-12

吴洪宾(1983-),男,硕士生,专业方向为动物遗传育种;e-mail:wuhongbin123456@stu.shzu.edu.cn。

赵宗胜(1969-),男,副教授,从事动物分子遗传研究;e-mail:zhaozongsh@shzu.edu.cn。