新疆良种驴DGAT2基因第3内含子PCR-SSCP多态性与体尺性状的相关性分析

王颜颜,托乎提·阿及德,肖海霞,王金富

(1石河子大学动物科技学院,石河子832003;2新疆畜牧科学院畜牧研究所,乌鲁木齐830000)

新疆良种驴DGAT2基因第3内含子PCR-SSCP多态性与体尺性状的相关性分析

王颜颜1,托乎提·阿及德2,肖海霞2,王金富1

(1石河子大学动物科技学院,石河子832003;2新疆畜牧科学院畜牧研究所,乌鲁木齐830000)

应用PCR-SSCP技术对新疆和田和喀什良种驴群体的DGAT2基因内含子3进行单核苷酸多态性检测和分析,探讨DGAT2基因作为候选基因影响新疆良种驴体尺性状的可能性。结果表明:DGAT2基因存在多态性,其第3内含子有两种等位基因A和B,存在AA和AB两种基因型,没有检测到BB基因型,其中AA基因型为优势基因型。AB型与AA型相比存在碱基发生A→G的突变,使赖氨酸突变为精氨酸。新疆和田良种驴AA与AB基因型个体相比,体高和胸围差异极显著(P＜0.01),体长差异显著(P＜0.05),AB型体高、胸围和体长高于AA型。新疆喀什良种驴AA与AB基因型个体相比,体高差异显著(P＜0.05),AB型的体高、胸围和体长高于AA型。新疆喀什良种驴的体高、体长和胸围高于和田良种驴,差异极显著(P＜0.01)。

新疆良种驴;DGAT2基因;内含子3;PCR-SSCP;多态性

新疆是我国养驴主产区之一,主要分布在天山以南喀什、和田、库车、吐鲁番地区。新疆驴属于小型驴种,起源于亚洲野驴,经长期人工驯化而成[1]。新疆驴是优良的地方品种,具有适应性强、耐粗饲、生长快等优良特性,被列入国家重点畜种保护范围。为加快新疆驴新品种培育,早在20世纪50-90年代从内地引进关中驴和德州驴,进行杂交选育出一批优良的群体,称为新疆良种驴,为新疆养驴业的可持续发展奠定了坚实的基础[2]。

二酰甘油酰基转移酶(diacylgycerol acyltransferase 2,DGAT2)是一种甘油酰基转移酶,是脂肪代谢中重要的酶之一,其与脂类在脂肪细胞中的沉积、血浆中甘油三酯的调节、肌肉中能量代谢以及畜禽卵母细胞的形成等有密切的关系[3-4]。目前,对于DGAT2基因的研究较多的畜禽主要是牛、羊、鹅,主要对畜禽的体尺、肉质和产奶性状影响进行了研究。徐秀蓉等[5]对鲁西牛、晋南牛、三河牛、秦川牛和利木赞×鲁西牛杂交后代几个群体为研究材料,利用PCR-RFLP对DGAT2基因内含子6和内含子7的多态性与生产性状的相关性进行分析,显示该基因与牛生产性状相关。房兴堂等[6]研究徐淮白山羊DGAT2基因内含子3多态性,分析结果显示,DGAT2基因对其体高有显著性的影响(P＜0.05)。

PCR-SSCP是近年来发展起来的分析基因突变的一项重要技术。该技术原理是将PCR扩增产物经变性后,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,由于分子构象不同的单链DNA会因其迁移率不同而得到分离,根据条带位置变化来判断目的片段是否存在突变[7]。

本试验利用 PCR-SSCP技术对新疆和田和喀什良种驴的DGAT2内含子3序列片段进行检测,并对不同SSCP带型的DNA片段进行测序,分析其多态性与新疆良种驴的生产性状的相关性,以期为提高新疆良种驴的产肉性能,开发和利用新疆驴资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

喀什良种成年驴54头,血样采自新疆喀什地区岳普湖县中心产区(♂:关中驴,♀:新疆驴);和田良种成年驴58头,血样采自新疆和田地区策勒县中心产区(♂:德州驴,♀:新疆驴)。

所采个体健康,无亲缘关系。每头良种驴由颈静脉采血20 mL,ACD抗凝,血液与抗凝剂充分混匀后,于-20℃冰箱中冷冻保存。

1.1.2 主要试剂与药品

Taq酶、dNTPs和Marker I均购自东盛生物工程有限公司。Tris碱、EDTA、琼脂糖、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺均购自美国Sigma公司。溴酚蓝、无水乙醇、冰醋酸、硝酸银、氢氧化钠、37%甲醛等药品为国产分析纯试剂。

1.1.3 仪器设备

PxE型 PCR仪:美国 Thermo Hybaid公司;Protean II XI Cell型垂直电泳槽:美国Bio-Rad公司;水平电泳仪:美国Bio-Rad公司;ImageMaster VDS型凝胶自动成像仪:美国Amersham Pharmaci Biotech公司。

1.1.4 PCR引物合成

根据 GenBank中发表的人(登录号:NT_033927.7)、小鼠(登录号:NT_039433.7)、大鼠(登录号:NW_047561.1)及牛DGA T2基因的DNA序列(登录号:NM_205793.2),比较牛与人、小鼠和大鼠的序列同源性分别为91%,89%和90%。目前关于家驴DGAT2基因研究尚DGAT2基因的结构(外显子与内含子),尚未见有研究报道。本实验根据牛的DGAT2基因序列,利用DNAMAN软件设计引物。扩增引物的序列如下:

上游引物:5′-CATTGCCGTGCTCTACTTCACCT-3′;

下游引物 :5′-A GTCTCGAAAGTA GCGCCACAA-3′。

1.2 方法

1.2.1 体尺测定

体尺测定参照文献[8]中的方法。

1)体高:从鬐甲顶点到地面的垂直距离;

2)体长:从肩端到臀端的斜线距离;

3)胸围:在鬐甲稍后方,用卷尺绕胸1周的长度。

1.2.2 基因组DNA的提取

驴血液基因组DNA的提取采用酚-氯仿抽提法[9]。

1.2.3 PCR扩增体系及参数

DGAT2基因内含子3 PCR扩增体系为:总体积15.0μL;HSTMTaq Mix Kit 6.0μL;Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.2μL;上游引物(10 pmol/mL)0.4μL;下游引物(10 pmol/mL)0.4μL;基因组DNA 1.0μL;ddH2O 7.0μL。

反应条件:95℃预变性,5 min;94℃变性,30 s;65℃退火,30 s;72℃延伸,30 s;34个循环,72℃,10 min,4℃保存。

1.2.4 SSCP分析

12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备条件:总体积30.0 mL;30%聚丙烯酰胺(29∶1)12.0 mL;5×TBE缓冲液6.0 mL;加ddH2O 12.0 mL;10%过硫酸铵0.21 mL;TEMED 0.025 mL。

取1μL PCR产物,加甲酰胺上样缓冲液2μL,98℃变性10 min后立即置冰浴保存10 min以上。将变性样品点于12%PAGE中,300 V电泳5 min后,再150 V恒压电泳30 h。电泳结束后,取凝胶于固定液中,固定约15 min,双蒸水洗2～3次,将凝胶置于银染液中,轻摇约20 min,双蒸水洗凝胶2～3次,倒入显色液轻摇至条带清晰出现,用双蒸水冲洗干净以终止反应。用凝胶成像仪拍照保存结果。

1.2.5 PCR产物测序

根据PCR-SSCP的分型结果,选择不同SSCP带型的PCR扩增产物进行回收纯化,由北京六合华大基因科技股份有限公司进行双向测序。

1.2.6 数据统计分析

统计基因型频率和基因频率[10];利用 SPSS 17.0软件进行方差分析,分析DGAT2基因位点的不同基因型与良种驴体尺性状的相关性。

2 结果与分析

2.1 PCR产物检测

对喀什与和田良种驴的血液基因组DNA的进行琼脂糖凝胶电泳检测,样品基因组DNA无降解,没有蛋白质、RNA等杂质。DNA样品浓度检测结果:OD260/OD280的比值均为1.76～1.82,OD260/OD230的比值均为2.21～2.35,说明提取的DNA符合实验要求。DGAT2基因内含子3的 PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果,如图1所示,可观察到1条清晰的亮带,初步判断 PCR扩增产物在预期的分子量范围之内,表明扩增产物可用于遗传多态性的检测。

图1 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测结果Fig.1 The result of detecting of PCR products of DGAT2 intron 3 by 1.5%agarose gel

2.2 PCR-SSCP结果与分析

采用SSCP分析DGAT2基因第3内含子的多态性,12%聚丙烯酰胺凝胶电泳结果见图2。由图2可以看出,该位点存在遗传多态性,有两种等位基因命名为A和B,存在AA和AB两种基因型,没有检测到BB基因型,其中AA基因型为优势基因型。纯合子AA型有两条带,杂合子AB型有四条带。

图2 DGAT基因内含子3扩增产物的SSCP分析Fig.2 SSCP analysis of DGAT2 intron 3

2.3 DGAT2基因内含子3的测序与分析

对DGAT2基因内含子3的两种基因型片段进行了回收和测序。测序结果表明:AB型与AA型相比第216位碱基发生A→G的突变,导致氨基酸编码改变,使赖氨酸突变为精氨酸。以下为AA和AB基因型序列比较结果:

2.4 DGAT2基因内含子3 PCR-SSCP多态性与良种驴体尺性状的相关性分析

2.4.1 基因型和等位基因频率及频率分布

结果表明(表1):在检测的2个群体中,基因型以纯合型AA型为优势基因型,基因型频率AA＞AB。AA和AB基因型频率在和田和喀什良种驴的基因型频率分别为:0.7069(0.2931)和0.6852(0.3148)。χ2检验结果表明,在2个群体中基因型频率和等位基因频率均差异极显著(P＜0.01)。2个群体之间比较,基因型频率和等位基因频率差异均不显著(P＞0.05)。2WH群体在该基因座没有处于 Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.01)。

表1 DGAT2基因内含子3PCR-SSCP基因型和等位基因频率(n=112)Tab.3 Genotype and allele frequencies of DGAT2 intron 3 by PCR-SSCP

2.4.2 不同基因型与体尺性状的相关性分析

和田和喀什良种驴的DGAT2基因内含子3的不同基因型与体高、胸围和体长的关系见表2。单因素方差分析结果(表2)表明:和田良种驴AA与AB基因型个体相比,AB型体高(P＜0.01)、胸围(P＞0.05)和体长(P＜0.01)均高于AA型。喀什良种驴AA与AB基因型个体相比,体高差异显著(P＜0.05),AB型体高、胸围和体长均高于AA型,但体长和胸围差异不显著(P＞0.05)。实验群体中喀什良种驴体高、体长和胸围高于和田良种驴,差异极显著(P＜0.01)。

表2 不同基因型与体尺性状的关系(n=112)Tab.2 Relation between different genotype and body measurement

3 讨论与结论

本实验检测了58头和田良种驴和54头喀什良种驴,纯合基因型AA型为优势基因型,AA基因型频率最高,杂合基因型AB型的基因型频率较低,但未检测到另一种纯合基因型BB型的个体,和田良种驴、喀什良种驴的基因型频率分别为 0.7069(0.2931)和0.6852(0.3148)。这与房兴堂等[6]、毛海霞等[11]、张争锋[12]的实验结果类似。房兴堂等[6]研究了徐淮白山羊DGAT2基因内含子3多态性,得到AA与AB两种基因型,其AA与AB基因型频率为0.9550(0.0450)。毛海霞等[11]对92头郏县红牛的DGAT2基因进行多态性分析,显出AA、AB两种不同基因型,AA与AB基因型频率为0.826(0.174)。张争锋[12]研究了南阳牛DGAT2基因内含子6检测到 Taq I多态性,有AA、AB两种不同基因型,AA与AB基因型频率为0.75(0.25)。

有报道指出与脂肪吸收、合成和沉积相关酶的基因可以作为研究奶牛和肉牛部分性状QTL的候选基因,其多态性可能和奶牛乳脂率以及肉牛体脂等性状相关,因此DGAT1和DGAT2基因都可以作为奶牛生产性状的候选基因[13]。同时有研究表明,DGAT2基因与动物的体重、体尺等指标有关。Perez等[14]将猪DGAT1基因定位于SSC4p15,在这一区域内存在可能影响猪生长速度、肌肉脂肪含量和脂肪酸组成的QTL。余刚等[15]在研究陕北白绒山羊DGAT1基因时发现该基因可以作为生长及胴体性状的候选基因,DGAT1基因AA型与BB型之间、AB型与BB型之间,陕北白绒山羊的断奶重、周岁重、胸围和管围4个性状差异极显著(P＜0.01),因此DGAT1基因可以作为陕北白绒山羊肉用性能的分子标记。新疆良种驴DGAT2基因多态性与体尺性状的分析结果表明,良种驴AA与AB基因型个体相比,AB型体高、胸围和体长均高于AA型。

本研究结果表明,DGA T2基因内含子3AB型与AA型相比第216位碱基发生A→G的突变,该碱基突变导致 TAG的合成量降低,进而可能引起脂肪合成和蛋白合成量变化,最终导致体高、胸围和体长这些体尺性状的改变。AB基因型对新疆良种驴的部分体尺性状可能有一定程度的影响,表明AB基因型作为体尺性状的候选分子遗传标记具有一定的可行性。为了提高新疆驴整体质量和数量,今后可以利用该基因对其它体尺性状进一步深入研究,通过新疆引进关中驴和德州驴广泛地应用人工授精技术把其优良性状快速地传递给后代,最终达到优质、高效的改良效果。

[1]王培基,赵芸君,王文奇,等.新疆驴的现状、品种特性及发展对策[J].山东畜牧兽医,2007,28(4):15-16.

[2]阿吉,王金富,路立里,等.新疆驴地方类群微卫星标记与体尺性状的相关分析[J].石河子大学学报:自然科学版,2007,25(4):449-452.

[3]Cases S,Smith S J,Zheng Y W,et al.Identification of a gene encoding an acylCoA:diacylglycerolacyltransferase,a key enzyme in triacylglycerol synthesis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(22):13018-13023.

[4]Wakimoto K,Chiba H,Michibata H,et al.A novel diacylglycerol acyltransferase(DGAT2)is decreased in hu-man psoriatic skin and increased in diabetic mice[J].Biochem Biophys Res Common,2003,310(2):296-302.

[5]徐秀容,高雪,许尚忠,等.牛DGAT2基因第6内含子Msp I-RFLPs和 Taq I-RFLPs及其与牛经济性状相关性研究[J].畜牧兽医学报,2005,36(10):981-986.

[6]房兴堂,徐海霞,陈宏,等.徐淮白山羊DGAT2基因内含子3多态性与生长性状关联分析[J].生物技术通讯,2009,20(6):814-817.

[7]张向晖,李奇凤,杨坚.乙胺丁醇耐药结核分枝杆菌embB基因分析[J].石河子大学学报:自然科学版,2007,25(6):668-671.

[8]张居农.实用养驴大全[M].中国农业出版社,2008:60-61,340-344.

[9]萨姆布鲁克,E.F弗里奇 T,曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南[M].金冬雁,黎孟枫.北京:科学技术出版社,1996.

[10]李宁.动物遗传学[M].2版.北京:中国农业出版社,2003:139-140.

[11]毛海霞,陈宏,陈付英,等.郏县红牛DGAT2基因多态性与生长性状的相关性分析[J].遗传,2008,30(3)329-332.

[12]张争锋.南阳牛几个基因的多态性及其与生长发育性状的相关性的研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2006.

[13]Winter A,Van Eckeveld M,Bininda Emonds O R,et al.Genomic organization of the DGAT2/MOGAT gene family in cattle(Bos taurus)and other mammals[J].Cytogenet Genome Res,2003,102(1/4):42-47.

[14]Perez Enciso M,Clop A,Noguera J L,et al.A QTL on pig chromosome 4 affects fatty acid metabolism:evidence from an Iberian by Land race intercross[J].J Anim Sci,2000,78(10):2525-2531.

[15]余刚,罗军,刘俊霞,等.陕北白绒山羊DGAT1基因外显子14多态性及其与部分生长和胴体性状的关系[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2008,36(5):1-6.

PCR-SSCP Polymorphism of Intron 3 of DGAT2 Gene of Fine-Breed Xinjiang Donkeys

WANG Yanyan1,TuohuTiaj2,XIAO Haixia2,WANGJinfu1
(1 College of Animal Science&Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Research Institute for Animal Science Academy of Xinjiang,Urumqi 830000,China)

PCR-SSCP method was applied to determine and analyse single nucleotide polymorphism of intron 3 of DGAT2 gene of fine breed the Hotan and Kashgar donkey in Xinjiang,the possibility of DGAT2 gene was studied as candidate gene of body measurement and slaughter quality.The results showed that amplifiedfragments existed polymorphism,DGAT2 gene intron had two alleles,A and B,two genotyping AA and AB,but BB was not found,AA is the dominant genotype,the Genotype frequency of which is 0.6964(0.3036).A→G mutation existed in AB,and changed the data encoding.Compared AA genotype with the AB of Hotan donkeys,the body height and chest circumference were very significantly different(P＜0.01),body length significantly different(P＜0.05).AA genotype compared with the AB of Kashgar donkeys,body height significantly different(P＜0.05),body height,chest circumference and body length AB-type were higher than AA.Body height,body length and chest circumference of Kashgar donkeys were higher than Hotan donkeys in experimental groups,the difference was significant(P＜0.01).

fine-breed Xinjiang donkeys;DGAT2 gene;inrton 3;PCR-SSCP;polymorphism

S813.9 < class="emphasis_bold">文献标识码:A

A

2010-03-18

新疆维吾尔自治区科技攻关项目(200731103)

王颜颜(1983-),女,硕士生,研究方向为动物生理与生物化学;e-mail:wyyzxg090909@sina.com。

托乎提·阿及德(1965-),男,维吾尔族,研究员,从事动物遗传育种研究。