高效液相色谱法同时检测6种甜味剂

蒋晓彤，陈国松，姜玲玲，赵艳丽

(鞍山市产品质量监督检验所，辽宁 鞍山 114006)

高效液相色谱法同时检测6种甜味剂

蒋晓彤，陈国松，姜玲玲，赵艳丽

(鞍山市产品质量监督检验所，辽宁 鞍山 114006)

建立同时测定6种人工合成甜味剂阿斯巴甜、糖精钠、甜蜜素、安塞蜜、纽甜、甜聚糖甙的高效液相色谱分析方法。以Platicil ODS柱为分离柱，20mmol/L硫酸铵缓冲溶液(pH4.4)-乙腈为流动相，进行梯度洗脱。采用二极管阵列检测器进行检测，整个分离过程在30min内完成。6种甜味剂在0.4～120mg/L范围内其质量浓度与峰面积的线性关系良好，相关系数为0.99967～0.99998，在4.0～10.0mg/kg范围内，样品加标回收率为85%～107%；相对标准偏差小于3.2%。该方法简便、快速，净化效果较好，可用于食品中6种甜味剂的同时测定。

高效液相色谱(HPLC)；人工合成甜味剂；糖精钠；甜蜜素；安塞蜜；阿斯巴甜；甜聚糖甙；纽甜

甜味剂是对能够赋予食品甜味的物质的总称。由于糖精钠(SA)、甜蜜素(SC)、安赛蜜(AK)、阿斯巴甜(ASP)、纽甜(NTM)、甜菊糖甙(S)等人工合成甜味剂具有高效、经济等优点，因此在食品中被广泛应用[1-3]。但其过量使用会造成一定的毒副作用。例如甜菊甙可能有一定致癌作用；阿斯巴甜可影响苯丙酮尿病患者的发育[4-5]；长期食用糖精钠会导致营养不良，其致癌可能性尚未完全排除[6-7]；甜蜜素可能有致癌性，其代谢产物环己胺对心血管系统和睾丸有毒理作用[8-11]。近年来发现有些商家对人工合成甜味剂的泛滥使用以及一些食品标签中未注明使用人工合成甜味剂，有些则以“糖蜜素”、“甜味料”、“蛋白糖”等混淆视听，以掩盖其产品的危害性，对消费者的身体健康构成危害，严重侵犯了广大消费者的利益[12-15]。本实验旨在建立多种甜味剂的同时检测法，以期为标准的建立提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

糖精钠 国家标准物质研究中心；甜蜜素 美国Sigma公司；安塞蜜、阿斯巴甜、甜聚糖甙、纽甜 美国Supelco公司；乙腈(色谱纯)；硫酸铵(优级纯)；其余试剂均为分析纯；实验用水为超纯水系统制备。

HP1100高效液相色谱仪(配有四元梯度泵、在线真空退气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器DAD) 美国安捷伦科技有限公司；AS3120A超声波振荡器 奥特塞恩斯仪器有限公司；pHS-3E型精密pH计上海精密科学仪器有限公司；Platicil ODS色谱柱；3K15离心机 美国Sigma公司；BP211D电子天平 北京Sartorius公司；ProElut PXC固相萃取柱。

1.2 色谱条件

色谱柱：ODS-C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为20mmol/L硫酸铵(用H3PO4调pH4.4)-乙腈；梯度洗脱程序：乙腈：0～2min，5%；2～30min，5%～50%；流速0.8mL/min；柱温为30℃；检测波长为200、226nm；进样量为20μL。

1.3 样品前处理

所有样品均为市场采集的样品，按照品种将其分为饮料、蜜饯、酱腌菜、酒类等，其中饮料按照国家标准进一步分为碳酸饮料、果汁、茶饮料、含乳饮料、植物蛋白饮料和固体饮料。

1.3.1 介质简单的样品

例如碳酸饮料、果酒、葡萄酒等，称取10g样品(精确至0.001g)，置于25mL容量瓶中，用水定容(如有乙醇需水浴加热除去乙醇后再用水定容至原体积)至刻度，混匀，经0.45μm滤膜过滤，滤液待上机测定。

1.3.2 介质复杂的样品

例如茶饮料、果汁等，称取6g样品(精确至0.001g)，置于25mL容量瓶中，用水定容至刻度，4000r/min离心10min，取上清液，待测。

1.3.3 介质为固体的样品

例如蜜饯、酱腌菜等，将样品粉碎，称取2g样品(精确至0.001g)，称取适量置于25mL，加水后并超声振荡20min，加水定容至25mL。4000r/min离心10min，取上清液，待测。

1.3.4 含乳饮料和植物蛋白饮料

称取6g样品(精确至0.001g)，置于25mL容量瓶中，依次加入2mL 0.08mol/L K4[Fe(CN)6](pH4.4)和2mL 0.25mol/L乙酸锌(pH4.5)溶液，剧烈振荡2min，以沉淀蛋白质，加水定容至刻度，4000r/min离心10min，取上清液，4000r/min离心10min，取上清液，待测。

1.4 试样的净化

取1.3.2～1.3.4节上清液3mL经固相萃取柱(事先经3mL乙腈活化，再用3mL水平衡)萃取。然后依次用3mL 20mmol/L硫酸铵和3mL乙腈洗脱，收集洗脱 液于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，经0.45μm滤膜过滤，滤液待上机测定。

1.5 测定

取处理液与混合标准使用液各20μL注入高效液相色谱分析仪进行分离，以保留时间定性，峰面积进行外标法定量。1.6 计算公式

样品中糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、甜菊糖甙、纽甜含量(X)，单位用(mg/kg)或(mg/L)表示，按式(1)计算。其中糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、甜菊糖甙、纽甜按200nm波长的峰面积计算；安赛蜜按226nm波长的峰面积计算。

式中：X为样品中糖精钠、甜蜜素、安赛蜜、阿斯巴甜、甜菊糖甙、纽甜含量/(mg/kg)或/(mg/L)；A2为样品峰面积；A1为标液峰面积；K为稀释倍数；C为标液质量浓度/(μg/mL)；m为样品质量/g；V为样品洗脱液浓缩定容体积/mL。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

本实验采用二极管阵列检测器，在190～400nm范围内对所有分析物进行光谱扫描。结果发现，6种甜味剂的最大吸收波长分别为：糖精钠2 04 nm、甜蜜素194nm、安塞蜜226nm、阿斯巴甜202nm、甜聚糖甙200nm、纽甜206nm。选择200nm波长对糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、甜聚糖甙、纽甜进行测定，选择226nm波长对安塞蜜进行测定。

2.2 流动相的选择

因为甲醇的截止波长为210nm左右，乙腈的截止波长为190nm左右，而糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、甜聚糖甙、纽甜选择在200nm处检测。且乙腈的溶剂强度较高，黏度较小，故测定时选用乙腈。

实验考察乙酸胺、硫酸铵、柠檬酸铵等溶液作为缓冲溶液是对分离度的影响，结果表明，乙腈-硫酸铵缓冲体系的洗脱效果最好。当硫酸铵浓度分别为10、20、40mmol/L时，20、40mmol/L分离效果较好，且二者相差不大，考虑到缓冲盐浓度增大，对色谱柱及系统管路造成的损害也会加大，所以选择20mmol/L硫酸铵最为缓冲盐溶液。调节20mmol/L硫酸铵缓冲液的pH值分别为3.0、4.0、4.4、5.0、6.0，在pH4.4条件下，6种甜味剂的色谱峰形和分离度良好。

流动相配比对分离效果的影响实验结果表明，当硫酸铵缓冲液pH4.4，乙腈体积分数小于8%时，几种甜味剂均可实现基线分离，但阿斯巴甜和纽甜的保留时间比较长，峰形拖尾。随着乙腈体积分数的增大，所有分析物的保留时间均逐渐缩短。乙腈的体积分数大于17%时，安塞蜜、糖精钠和甜蜜素的色谱峰重叠，纽甜的保留时间大于40min。采用梯度洗脱可以缩短分析时间、提高分离度、改善峰形。考虑到本实验在短波长处测定，梯度增加太快会严重漂移，增加太慢分析时间就会加长，最终选择的梯度洗脱程序为乙腈：0～2min，5%；2～30min，5%～50%；流速0.8mL/min。在此色谱条件下，6种甜味剂的标准物质色谱图见图1。

表3 实际样品的加标回收率结果Table 3 Recovery rates for 6 sweeteners

图1 标准混合溶液的色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed sweetener standards

2.3 线性范围、精密度和检出限

表1 线性关系与检出限Table 1 Linear relationship and detection limit of this method

在确定的最佳色谱分离条件下对一系列不同质量浓度的混合标准溶液进行色谱测定，以各组分的峰面积(A)对质量浓度(C/(mg/L))绘制标准曲线，其线性关系、相关系数、检出限(RSN=3)和相对标准偏差见表1。结果表明，所有分析物在0.4～120mg/L范围内均有良好的线性关系，可以满足定量分析的需要。

2.4 实际样品中甜味剂含量及加标回收率的测定

表2 实际样品的测定结果(n=3)Table 2 Determination results for real samples

在表2中测定结果基础上，在线性范围内加入一定量的标准品做加标回收实验。每种样品平行测定3次，测定结果见表3。平均加标回收率在85%～107%，相对标准偏差小于3.2%，测定结果令人满意。

3 结 论

通过对多种甜味剂高效液相色谱法的实验分析，6种甜味剂在4.0～10.0mg/kg范围内，样品加标回收率为85%～107%；相对标准偏差小于3.2%。该方法简便、快速，净化效果较好，可用于食品中多种甜味剂的检测方法，以消除对商品中单一甜味剂检测而造成其他甜味剂漏检的可能性。

[1] 蔡云升. 人工合成甜味剂的特点及其发展趋势[J]. 食品技术动态,2006(2): 15-16.

[2] 郑鹏然, 周树南. 食品卫生全书[M]. 北京: 红旗出版社, 1996: 642-643.

[3] 吐松. 新型强力甜味剂纽甜的合成研究进展[J]. 化工进展, 2008, 27(1): 6-9.

[4] 陈金东, 李蔚. 高效液相色谱法同时测定食品中阿斯巴甜、阿力甜[J]. 中国卫生检验杂志, 2006(9): 225-227.

[5] 赵亚华, 查玉立. 高效液相色谱法同时测定饮料中八种添加剂的实验研究[J]. 安徽预防医学杂志, 2000(2): 104-105.

[6] 许龙福. 高效液相色谱法同时测定食品中安赛蜜、糖精、苯甲酸、山梨酸和咖啡因[J]. 分析试验室, 2002(2): 235-238.

[7] 魏明, 向仲朝. HPLC测定食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的样品前处理[J]. 食品科技, 2006(9): 240-241.

[8] 白艳玲, 王丽玲. 超声提取气相色谱法快速测定食品中甜蜜素含量的研究[J]. 中国热带医学, 2004, 4(2): 190-191.

[9] 张秀尧. 反相高效液相色谱同时测定食品中常见的8种食品添加剂[J]. 色谱, 2000, 18(6): 539-541.

[10] 齐竹华, 曲峰, 刘克纳. 离子色谱法电化学检测复合甜味剂和饮料中的甜味素[J]. 环境化纤, 1999, 18(4): 380-382.

[11] 温志海, 占春瑞, 鄢爱平. 液相色谱法测定酱油中及其制品中甜蜜素的研究[J]. 检验检疫科学[J]. 2004, 14(2): 25-26.

[12] GALLETTI G C, BOCCHINI P. High-performance liquid chromatography with electrochemical detection of aspartame with a post-column photochemical reactor[J]. Journal of Chromatography A, 1996, 729(1/2):393-398.

[13] 黄百芬, 涨文娟, 沈向红. 高效液相色谱法同时测定酱油或饮料中的8种防腐剂和3种甜味剂[J]. 中国卫生检验杂志, 2005(10): 114-116.

[14] 李健, 刘宁. HPLC法测定酱油中的甜味剂[J]. 食品科学, 2006, 27(10): 59-62.

[15] GB 2760—1996食品添加剂使用卫生标准[S].

Simultaneous HPLC Determination of 6 Sweeteners

JIANG Xiao-tong，CHEN Guo-song，JIANG Ling-ling，ZHAO Yan-li
(Anshan Institute of Products Quality Supervision and Inspection, Anshan 114006, China)

A reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) method was established to simultaneously determine six artificial sweeteners including aspartame (ASP), sodium saccharin (SA), sodium cyclamate (SC), acesulfame potassium (AK), neotame (NTM) and stevioside. The separation was carried out on a Platicil ODS (250 mm × 4.6 mm, 5μm)column through gradient elution using 20 mmol/L (NH4)2SO4-acetonitrile (pH 4.4) as mobile phase. The whole separation process was completed in 30 min before diode array detection. An excellent linear relationship between peak area and sweetener concentration in the range of 0.4－120 mg/L with a correlation coefficient varying from 0.99967 to 0.99998 was observed. The recovery rates of spiked samples in the range of 4.0－10.0 mg/kg ranged from 85% to 107% with a relative standard deviation less than 3.2%. Therefore, this method is characteristics of simple operation, rapid detection and excellent purification efficiency so that it can be used for the routine analysis of these sweet additives in foods and beverages.

HPLC；artificial sweeteners；sodium saccharin (SA)；sodium cyclamate (SC)；acesulfame potassium(AK)；aspartame (ASP)；stevioside (S)；neotame (NTM)

TS207.3

A

1002-6630(2011)06-0165-04

2010-03-28

国家质检总局质检公益性科研项目(200810923)

蒋晓彤(1967—)，女，高级工程师，学士，主要从事食品检测研究。E-mail：lnaszjs@sohu.com