次乌头碱对心肌细胞Ca2+调控蛋白mRNA表达的影响*

李志勇,谭 鹏,赵 晖,李 飞,孙建宁△

(1.中央民族大学中国少数民族传统医学研究院,北京100081;2.北京中医药大学中药学院,北京100012;3.首都医科大学中医药学院,北京100069)

含有乌头碱、中乌头碱、次乌头碱(hypaconitine,HA)等生物碱的天然药物主要包括附子、川乌、草乌、雪上一枝蒿等药材,因含有上述毒性成分在临床应用中极易发生中毒,损伤机体神经系统与心血管系统,最突出的体征为心律失常[1-4]。有研究显示,HA在附子炮制品及中成药中都有存在[5-8],且附子的毒-效表达与乌头碱、中乌头碱、HA在炮制过程中的差异配比存在相关性[9],HA在正常大鼠及离体心脏、原代培养乳鼠心肌细胞上都能引发严重心律失常[10-11]。现将HA对心肌细胞L-钙通道α1C亚基、细胞内钙调蛋白(CaM)及肌质网上雷诺定受体(Ry R2)mRNA表达的影响报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与药品 3 d乳大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)雌雄不拘,动物许可证号:SCXK(京)2002-0003。HA;(中国食品药品检定研究院),批号:200404,纯度大于或等于98%,用二甲基亚砜(DMSO)溶解,制成贮备液。

1.2 试剂与仪器 达氏修正依氏培养基/F12(DMEM/F12)购自美国sigma公司,批号 086K 83521;胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ型(CoⅡ)、四噻唑兰(MTT)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA Na2)购自美国Amresco公司;5-溴-2-脱氧尿核苷购自Brd U,Roche公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司,批号071031;First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司,批号 00020634;SYBR Green PCR Master Mix购自 Applied Biosystems公司,批号43049155。CJT型超净工作台购自北京昌平长城空气净化设备公司;RCO-3000T-5V型CO2恒温培养箱购自美国G.S.公司;DMILHC倒置相差显微镜购自德国Leica公司;YXOGO2型电热式蒸汽消毒器购自山东新华医疗器械股份有限公司;400R低温离心机购自德国Heraeus公司;GeneAmp 5700 TaqMAN PCR仪购自美国AppliedBiosystems公司;凝胶图像分析仪、ImageMaster VDS购自美国pharmacia Biotech公司;OYY-Ⅲ-5型电泳仪购自北京六一仪器厂;YLD-2000电热恒温鼓风干燥箱购自黄石市恒丰医疗器械有限公司;HZQ-C空气浴振荡器购自哈尔滨市东明医疗仪器厂。

表1 引物序列

1.3 方法

1.3.1 心肌细胞制备与培养 超净工作台内无菌条件下取出乳鼠心脏,在预冷D-Hank′s液中清洗3～4次。将心肌组织剪为1 mm3大小,加入3倍体积量的消化酶(终浓度0.04%的胰酶和终浓度0.04%的CoⅡ混合液,用前混匀),放于 37℃,每分钟30～40转空气浴振荡10～20 min,反复至消化完全,除第1次外,收集各次消化后的上清液,加入等体积含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化,于4℃,1 000 r/min离心10 min,收集所有细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,吹打成单细胞悬液,经200目尼龙网过滤去除未消化的组织块。接种于25 cm2的卡式培养瓶中,置于 37℃、5%CO2、饱和湿度孵箱中,用差速贴壁法分离非心肌细胞,每次90 min,共2次。所得未贴壁细胞(心肌细胞)计数,按 8×105cell/m L接种于6孔培养板。培养液中加入终浓度为0.1 mmol/L Brd U抑制成纤维细胞增殖,添加双抗(100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)预防细菌污染,37℃、5%CO2、91%湿度环境中培养,约每36～48小时换1次培养液,培养3～4 d后使用。

1.3.2 实验分组 实验分为空白对照组、HA 30μM/L组、HA 60μM/L组及HA 120μM/L组。

1.3.3 检测心肌细胞 L-钙通道α1C、CaM 及 Ry R2m RNA的表达 给药前12 h更换无血清DMEM/F12培养液,分别将30、60、120μM/L HA与心肌细胞共同孵育15 min后弃含药培养液,用 D-Hank′s液清洗 2～ 3次。 同时,将 HA 30、60 μM/L组心肌细胞与HA共同孵育的时间增设15、60 min两个时间点,以期观察HA对心肌细胞 L-钙通道α1C、CaM 及Ry R2m RNA表达的动态变化。分别在培养板内加入Trizol提取细胞总RNA,紫外分光光度计A260 nm处测定吸光度,定量RNA浓度。根据美国基因生物库的基因核酸序列,选取鸟嘌呤加胞嘧啶(G+C)含量约50%的无发卡结构,相互间无同源序列两段特异性保守序列,用Primer Premier5.0软件设计引物(北京赛百盛生物技术公司进行合成),引物序列见表1。参照Fermentas公司逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)一步法试剂盒说明书操作。取适量PCR反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶,100 V/cm凝胶的电压下电泳。生物电泳图像分析仪测定扩增大曲线下的吸光度值,计算各样品的L-钙通道α1C/-actin、CaM/-actin、Ry R2/-actin。

1.4 统计学处理 应用SAS8.1软件进行统计学数据分析,数据以±s表示。各组数据进行单因素方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

HA对心肌细胞L-钙通道α1C、CaM及 RyR2 mRNA表达的影响见图1及表2、3。

表2 HA对心肌细胞L-钙通道α1C、CaM 及Ry R2 mRNA表达的影响(15 min)

表 3 HA对心肌细胞 L-钙通道α1C、CaM及 Ry R2 m RNA表达的动态影响

图1 琼脂糖凝胶电泳

3 讨 论

Ca2+是心肌细胞最重要的第2信使,在维持心脏正常节律和兴奋-收缩偶联中发挥关键作用[12-13]。细胞膜L-钙通道激活,Ca2+入胞质后通过Ca2+/CaM途径调节胞内Ca2+浓度,激活肌质网Ry R2,使肌质网内Ca2+经 Ry R2大量进入胞质,引起细胞收缩[14]。外源性药物触发 L-钙通道、CaM、Ry R2等相关调控蛋白的基因改变,将可能导致细胞内Ca2+稳态失调,继而诱发严重的药源性心律失常。作者前期研究证实,HA引起的乳大鼠心肌细胞快速性心律失常剂量为6～60μΜ/L,导致心肌细胞出现停搏的剂量大于或等于60μΜ/L,HA与心肌细胞共同孵育5～30 min时细胞的搏动频率增加最显著[11]。流式细胞检测HA引起的心肌细胞内游离Ca2+升高多出现在给药后15 min,说明心肌细胞内Ca2+参与了HA所致的心律失常发生过程。

本研究发现,HA能引起心肌细胞L-钙通道α1C mRNA高表达,α1C亚基不仅是 L-钙通道构成Ca2+进入孔道的主要结构,也是细胞内Ca2+浓度增高时Ca2+-CaM复合物反馈性调节L-钙通道的位点[15]。α1C mRNA的高水平表达表明在HA作用下,L-钙通道正处于高度开放状态,亦提示细胞内游离Ca2+正处于较高浓度。Ry R2是细胞肌质网钙释放入胞质的主要通道,正常生理条件下受细胞内Ca2+/CaM调控,介导心肌兴奋-收缩偶联及维持细胞内Ca2+稳态。HA能同时增强心肌细胞CaM和Ry R2基因表达量,表明CaM和Ry R2可能也参与了HA所致的心肌细胞内“钙超载”过程。综合不同剂量(60、30 μΜ/L)、不同作用时间(5、15、60 min)HA 对上述mRNA转录水平的影响,发现 L-钙通道、CaM 和 Ry R2基因的表达量增高与心肌细胞内游离Ca2+浓度的升高相伴发生,进一步证实HA极有可能通过对上述钙调控基因mRNA表达的影响而导致心肌细胞“钙超载”及后续心律失常的发生。

在乌头碱类天然药物临床中毒所致的心律失常中,HA的存在可能是导致其毒性反应的主要物质基础之一。心肌细胞L-钙通道、CaM与Ry R2等钙调控蛋白可能是中毒性心律失常发生的关键环节。因此,在乌头碱类天然药物中毒解救中,干预上述靶点,调节、恢复上述基因的正常表达可达到解除中毒性心律失常的目的。

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