利用总状毛霉生产含——亚麻酸豆豉的初步研究

陆 合，张碧波，罗雪莲

(1.重庆医科大学微生物教研室，重庆400016;2.重庆文理学院生命科学系，重庆402168)

陆 合1，张碧波2，罗雪莲2

(1.重庆医科大学微生物教研室，重庆400016;2.重庆文理学院生命科学系，重庆402168)

豆豉是中国古老的食品。研究表明:利用毛霉发酵豆豉生产GLA是可行的，最佳的接种量为每10g煮熟的大豆接种5.3×107个孢子，发酵最适温度26℃，最佳豆豉曲发酵时间为72～96h，豆豉曲后发酵8d时获得含量比较平稳的γ－亚麻酸。在研究的最佳条件下发酵豆豉，能获得3倍于传统发酵豆豉的GLA。

γ－亚麻酸，豆豉，毛霉，发酵

GLA(gamma－linolenic acid GLA;18∶3Δ6，9，12)作为人体前列腺素类、白三烯、血栓素等生理活性物质的前体物质，具有降低胆固醇、血压、血粘度等作用，作为一类功能性食品原料已广泛用于医药、食品等方面［1］。由于植物生产脂肪酸受到季节、环境等多因素限制［2］，利用微生物生产多不饱和脂肪酸就成为新的发展方向。国内外对微生物生产不饱和脂肪酸都已进行了大量研究［3－5］，其中部分菌株已开始用于工业发酵生产GLA，如深黄被孢霉(Mortierella isabelline)、毛霉(Mucor)［6－7］。但这些研究和生产主要集中在通过微生物发酵获得多不饱和脂肪酸后，再分离提纯多不饱和脂肪酸，添加到食品中去。由于分离提纯多不饱和脂肪酸的成本大、难度高以及生产菌株本身的安全性等问题，使得微生物生产多不饱和脂肪酸的运用受到限制。豆豉作为我国一种古老的食品已经被人们普遍接受，根据发酵微生物的不同可以分为细菌类型(山东地区)，毛霉型(重庆永川)和曲霉型(广东阳江)3种，虽然生产地方和方式不一样，但它们之间仅有一些小的风味区别［8］。由于在豆豉中发现了抗氧化、抗菌的物质，从而使得豆豉的价值大大提高，但还远远不够［9］。如何进一步开发和提高豆豉中的生物活性物质成为当前研究的重点。Kim和Li等［10－11］通过对中国国内常见豆豉品种进行成分分析，在商品豆豉中发现了多种不饱和脂肪酸，但并没有发现GLA。汪晨辉、章银良［12－13］等人都曾报道过利用毛霉属菌株发酵生产GLA，永川豆豉恰好属于毛霉型，发酵过程中主要是毛霉在起作用，这就意味着利用毛霉菌株发酵豆豉生产GLA是可行的。本研究通过在豆豉发酵中接种具有食品安全级的总状毛霉，调整豆豉发酵的条件，最终在大众食品豆豉中获得了较高的GLA，降低了GLA的生产成本，使其能在直接食用豆豉的同时获得GLA，为开发和提高豆豉的品质提供了新的证据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

总状毛霉Mucor racemosus CICC3039 从中国工业微生物菌种保存管理中心购买，利用固态PDA培养基转接活化后，转入麦芽汁琼脂培养基(每升水含麦芽膏粉130g，氯霉素0.1g，琼脂15g)，30℃培养3d待用;麦角固醇、γ－亚麻酸标样 购自Sigma公司;其他试剂 购自国药化学试剂公司。

气相色谱仪GC－2010 岛津公司;752S可见紫外分光光度计。

1.2 豆豉的发酵生产

豆豉的生产参照周玉兰的方法进行［14］。

1.2.1 原料处理 取上等黄豆1000g，用水洗去混有的砂粒杂质等，将其在40℃热水中浸泡120min后，常压下蒸煮150min。

1.2.2 豆豉曲的制作 蒸煮后大豆出锅，冷却至35℃左右，进行接种。接种的方法可以是自然接种或者是人工接种总状毛霉M.racemosus 3039的菌丝体或孢子，人工接种量为0.4%。拌匀后放入制曲容器簸箕后转入烘箱，保持箱温26℃，每隔6h观察，20h后进行第一次翻曲，28h后进行第二次翻曲，制曲期间通过翻曲严格控制曲温。制曲总时间为4d。

1.2.3 豆豉的后发酵 发酵成熟的豆豉曲中加入12%的盐，混匀后装入陶罐中至八、九成满，层层压实，置于28～32℃恒温室中保温发酵，发酵时间控制在15d左右。

1.3 菌丝体生物量的测定

依照姜绪林等人的方法［15］，精确称取0.1g菌丝，放入25mL比色管中，加入10mL醇碱混合液，在恒温水浴中反应1.5h。冷却、离心后，取上清液沸水浴中将乙醇蒸尽，然后再加入10mL无水乙醚，充分振荡，萃取2h。吸取上层乙醚层，将乙醚蒸尽后，用无水乙醇溶解并定容至10mL。用紫外分光光度计在波长282nm处进行比色，测定OD值。与测定的麦角固醇含量标准曲线进行比对，最终得到菌丝体的量。

1.4 脂肪酸的甲酯化及气相色谱分析

参照刘莉等人的方法［16］。将豆豉曲或后发酵好的豆豉用研钵研粹后，用石油醚∶乙醚(1∶1)的有机混合溶剂浸提1d后，用5%的KOH－甲醇液进行酯化，用岛津公司生产的气相色谱仪GC－2010，进行气相色谱分析。分析条件为载气压力 150kPa，柱温220℃，进样温度250℃，FID250℃。GLA的含量采用面积归一法和内标法。

所有实验均重复3次，数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 不同接种方法对豆豉产GLA的影响

豆豉生产中，手工作坊通常采用的是自然接种方式，这导致豆豉的风味和品质存在极大差异。所以要想提高豆豉的生产水平、稳定豆豉的风味与品质、使豆豉中GLA的含量稳定，就必须对豆豉发酵的接种方法进行相应的调整，固定接种方法。目前在豆豉曲的生产过程中人工接种方法有孢子和菌丝体接种二种，GC分析发现，利用不同的接种方法，产生的GLA不一样。从表1可以看出，用5.0×106个总状毛霉孢子和与孢子浓度相当的菌丝体分别接种每10g大豆后，在同样的豆豉曲发酵时间内，孢子接种比用菌丝体接种后产生的GLA要高一半，所以在后面的优化中就使用人工的孢子接种方法。

表1 接种方式对豆豉中GLA含量的影响

2.2 接种量大小对豆豉曲中GLA的影响

在表2中，可以明显看到在接种生产豆豉曲的过程中，同等发酵条件下接种量的大小也同样会影响到豆豉曲中GLA的量，在营养充足的条件下，加大接种量有利于提高豆豉曲中总状毛霉的生物量，进而能加大豆豉曲中GLA的含量。当接种量为5.3×107个/10g时，产生的GLA量最多。

表2 接种量对豆豉曲中GLA含量的影响

2.3 制曲时间对豆豉曲中GLA的影响

豆豉曲生产的好坏是整个豆豉发酵中的重点。从图1可以看出，在不同生长温度下，随着发酵时间的延长，总状毛霉的生物量都表现为增长。发酵4～5d时，菌丝体的生长进入对数生长末期，发酵温度在26℃时菌丝体的生物量最大。通过图1、图2看到，GLA在豆豉曲中的含量随着生物量的生长而逐渐增加。发酵到第4d时，除22℃外，其他培养温度的GLA量都已经达到最高，因此把豆豉曲的制曲时间定在4d。

图1 不同发酵温度对菌丝体生物量的影响

图2 不同发酵温度对GLA的影响

2.4 后发酵时间对豆豉中GLA的影响

后发酵生产是豆豉制作的最后一道工序，这时由于所加食盐的抑制，使得总状毛霉菌丝体的生长基本上处于停顿。所以这时的GLA含量不会表现出明显的增加，相反由于高盐的胁迫，GLA的含量肯定会随着后发酵时间的延长而降低。从图3可以发现，随着后发酵时间的延长，豆豉中的GLA量呈现出明显的下降趋势。特别是在后发酵8d后GLA的含量出现了明显的下降。如果继续延长后发酵时间，包括商品豆豉还要在货架上放置较长的时间，到最后豆豉中GLA的含量完全可能趋于零。这可能就是在商品豆豉中没有发现GLA的原因之一。所以我们在综合考虑豆豉的品质和GLA的含量后，将后发酵时间定在8d内。

表3 新工艺豆豉产GLA与其它产GLA的比较

图3 后发酵时间对GLA量的影响

2.5 豆豉产GLA与其它方法产GLA的比较

对如何利用真菌发酵生产GLA，已经进行了菌种筛选、诱变和优化发酵条件等研究。通过表3可以看到，将豆豉发酵生产GLA与其它真菌发酵生产GLA进行比较不难发现［5，13，18］，利用豆豉生产获得的GLA含量虽然不是最高，但它能有效避免其它真菌发酵方法生产后需要高费用的提纯过程，同时因为可以直接通过食用豆豉获得GLA，从而使补充GLA的方法简单化。

3 讨论

国内外对利用微生物生产不饱和脂肪酸已进行了大量研究，但研究主要集中在通过微生物获得多不饱和脂肪酸后，分离、添加到食品中。由于分离提纯的成本大、难度高等使得多不饱和脂肪酸的运用受到限制。豆豉作为我国一种古老的食品已经被人们普遍接受，生产工艺比纳豆复杂，已在豆豉中发现抗氧化、抗菌等多种活性物质存在，但由于手工作坊生产工艺落后，导致传统生产豆豉的方法均存在着质量不稳定、发酵周期长等缺点。如何进一步开发、提高、稳定豆豉中的生物活性物质成为当前研究的重点。

总状毛霉菌株属于毛霉属，是一类食品安全性较高的微生物，主要用于生产豆豉、豆腐乳等。目前已有利用不同毛霉属菌株直接发酵生产γ－亚麻酸的报道，但大规模工业生产的工艺尚在研究中。本研究通过在豆豉发酵中接种具有食品安全级的总状毛霉，调整豆豉发酵的条件，最终在大众食品豆豉中获得了较高的GLA，降低了GLA的生产成本，使其在直接食用豆豉的同时获得GLA，为开发和提高豆豉的品质提供了新的证据。

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Study on production of γ－linolenic acid(GLA)by Douchi using Mucor racemosus

LU He1，ZHANG Bi－bo2，LUO Xue－lian2
(1.Department of Microbiology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China;2.College of Life Sciences，Chongqing University of Arts and Sciences，Chongqing 402168，China)

Douchi is a popular oriental food in China.The studies showed that production of γ－linolenic acid by Douchi using Mucor racemosus was feasible.The optimal amount of inoculums was 5.30×107spores/10g cooked soybean.The optimal temperature for fermentation was about 26℃，GLA content plateau could be obtained between 72h and 96h during the fermentation of Douchiqu then 8d of post－fermentation.Under the optimal fermentation conditions，GLA content in Douchi was over 3 times than that of the traditional spontaneous inoculums fermentation process.Key words:γ－linolenic acid;Douchi;Mucor.sp;fermentation

TS201.3

A

1002－0306(2011)04－0201－03

2010－03－24

陆合(1978－)，男，讲师，主要从事分子微生物研究。