解茂蕾,张子德,马俊莲,赵丛枝,王侠轶,张晓娜
(河北农业大学食品科技学院,河北保定071000)
红提葡萄致病菌的筛选及丁香抑菌成分提取工艺研究
解茂蕾,张子德*,马俊莲,赵丛枝,王侠轶,张晓娜
(河北农业大学食品科技学院,河北保定071000)
以红提葡萄为试材,对采后致病菌进行了筛选和纯化;以筛选出的红提葡萄主要致病菌为目的菌,对丁香抑菌成分提取工艺进行了研究。研究表明:筛选出的2号病菌可导致红提葡萄黑点病,该菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、复端孢属;丁香抑菌成分的适宜提取条件为:乙醇浓度75%,料液比1∶15,提取时间45min,提取温度40℃,在此条件下的抑菌圈直径为1.957cm。
红提葡萄,致病菌,丁香,抑菌成分,提取工艺
葡萄是主要水果之一,其皮薄、含水量高,易受病菌侵染从而导致在贮存或运输过程中腐烂、霉变。目前市场上普遍采用SO2来防止葡萄霉烂,效果较好,但在果肉组织中有亚硫酸盐残留,对人体健康有不良影响[1-2]。病原菌引起的腐烂病害是葡萄贮藏过程中的主要问题。充分了解葡萄采后病原菌种类,有效控制葡萄采后病害,可为其保鲜技术提供理论基础[3]。化学防腐剂是果蔬采后普遍使用的防腐保鲜方法,但由于化学防腐剂危害健康、污染环境等缺陷;且用SO2保鲜贮藏保鲜过程中极易发生SO2伤害,严重影响果实的商品价值和食用价值[4];因此天然防腐剂的研究和开发利用日益显示出其重要性和迫切性。很多研究已证实了中草药的杀菌成分对果蔬贮藏保鲜的效果,其中丁香提取物的抑菌效果尤为显著[5]。研制天然中草药防腐保鲜剂是一个很有潜力的发展方向[6]。近年来,对葡萄采后病原菌的研究鲜有报道,特别是有关红提葡萄的研究尚未见报道。本文着重对红提葡萄的采后病原菌种类及丁香提取物的抑菌效果进行了研究。
红提葡萄 购于保定市果品批发市场;丁香购于保定市老百姓大药房。
KQ5200B型超声波清洗器。
1.2.1 田间带菌检出 取外观完好的果实各部位,用组织分离法在无菌条件下分离(PDA培养基),检查组织带菌情况。
1.2.2 从采后染病组织中分离病原菌 葡萄在(0±1)℃条件下,从染病腐烂的葡萄果实中取样。取样方法:切取距离病斑2mm处的组织,表面灭菌后接种到PDA培养基上。25~28℃下培养3~5d,当培养出的菌落直径为1cm时,用接种针挑取菌落边缘菌丝接入另一皿PDA培养基上,同样于25~28℃培养。重复上述操作3次即可作为纯化菌种回接果实,如发病症状与之前相同,便可作为采后病原菌转接入试管,4℃冰箱保存,作为供试菌种进行进一步的鉴定等研究。1.2.3 致病性鉴定
1.2.3.1 待返接果粒的准备 选取健康无病果实,用清水洗净后用70%乙醇溶液浸泡2min,再用无菌水冲洗干净,放在超净工作台上晾干备用。每个菌株接种10个果粒,每果粒上接种1块菌饼,分别设有伤和无伤两种空白对照。
1.2.3.2 接种用病原菌的制备 取在PDA培养基上培养3~5d的新鲜菌株,用打孔器取直径约为5mm的菌体(含部分培养基,可较好地粘着在果实表面)接种。
1.2.3.3 返接实验 采用已纯化菌株回接被测果粒,分“有伤”和“无伤”两种接种方式,通过接种观察病斑发展速度和发病程度,判断被接菌株致病能力的大小。有伤接种:分别在每个果粒上用接种针刺破5个孔,孔眼可集中在一起使直径约5mm,用打孔器取制备好的病原菌株,菌饼直径约5mm,接种至伤口处,重复三次;无伤接种:同穗另取完好果粒直接接种,重复三次。两种接种方式分别设空白对照。
1.2.4 病原菌鉴定[7-8]病原菌的鉴定主要以病害的症状、菌落形态及菌丝、孢子、分生孢子梗、分生孢子等特征,检索文献确定其属和种。
1.2.5 丁香抑菌成分提取条件实验
1.2.5.1 乙醇浓度对丁香提取物抑菌作用的影响 丁香取5份,每份10g,加入70%、75%、80%、85%、90%的乙醇100mL,设定超声波提取时间为15min、提取温度55℃。
1.2.5.2 提取时间对丁香提取物抑菌作用的影响丁香取5份,每份10g,加入80%乙醇100mL,设定超声波提取时间分别为30、40、50、60、70min,设定超声波提取温度为55℃。
1.2.5.3 提取温度对丁香提取物抑菌作用的影响丁香取5份,每份10g,加入80%乙醇100mL,设定超声波提取温度分别为40、45、50、55、60℃,设定超声波提取时间为15min。
1.2.5.4 不同料液比对丁香取物抑菌作用的影响每种药材分别取5份,每份10g,设定乙醇浓度80%、超声波提取时间15min、超声波提取温度55℃,料液比梯度为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30。
根据单因素实验结果,采用四因素三水平L9(34)正交实验设计优化超声提取条件,实验因素及水平见表1。每一实验条件重复三次,共27组实验,抑菌圈直径取3组平均值。
表1 正交实验因素水平表L9(34)
本实验共筛选出5种病菌,经返接实验观察,接种1、3、4、5号病菌的红提葡萄发病慢,且只在有伤接种病菌的情况下发病;而接种2号病菌的红提葡萄在接种后的第3d开始发病,且有伤和无伤接种条件下均发病。因此确定2号病菌为主要致病菌。接种病菌2的葡萄病部颜色较深,菌斑周围(葡萄病部中央)有一白点,边界明显,结合一些资料可以初步判定病菌2引起的是葡萄黑点病。
病菌2在PDA培养基上培养初期为白色后逐渐变成粉红色,再培养1d后呈粉红和白色相间的棉絮状病菌。
在显微镜下观察病菌2,可以看到病菌2的分生孢子梗无色、散生、不分枝,顶端束生分生孢子;分生孢子呈头状、卵圆形、大小不等;下端细胞具有一明显的喙状突起。通过病菌检索,可初步确定病菌2属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、复端孢属的病菌。
2.3.1 乙醇浓度对丁香提取物抑菌效果的影响 图1显示了乙醇浓度对丁香抑菌圈直径的影响。当乙醇浓度在70%~90%之间变化时,丁香提取物的抑菌圈直径呈先增加后下降的趋势。丁香的最大抑菌圈直径1.55cm出现在乙醇浓度为80%处。由此可见,乙醇浓度在80%时,丁香抑菌成分能被充分提取。所以将乙醇浓度75%、80%、85%设为正交实验的乙醇浓度水平。
图1 不同乙醇浓度对丁香提取物抑菌效果的影响
2.3.2 提取时间对丁香提取物抑菌效果的影响 图2显示了不同处理时间对丁香抑菌圈直径的影响。丁香的最大抑菌圈直径1.437cm出现在提取时间为50min处。由此可见,并非超声提取时间越长抑菌率越高,在提取时间为50min时,抑菌率达到最大值,提取时间过长,反而不利于中草药提取物对致病菌的抑制作用。因此,将处理时间40、50、60min设为正交实验的处理时间水平。
2.3.3 提取温度对丁香提取物抑菌效果的影响 图3显示了不同提取温度对丁香抑菌圈直径的影响。在实验所设置的温度范围内,抑菌圈直径随温度的升高先增大,当提取温度在50℃时,丁香提取物的抑菌圈直径达到最大值,而后一直呈下降趋势,这表明药材抑菌成分在高温度下受到较大的破坏。丁香的最大抑菌圈直径1.333cm出现在提取温度50℃处。因此,将提取温度45、50、55℃设为正交实验的提取温度水平。
图2 不同提取时间对丁香提取物抑菌效果的影响
图3 不同提取温度对丁香提取物抑菌效果的影响
2.3.4 料液比对丁香提取物抑菌效果的影响 图4显示了料液比对丁香提取物抑菌率的影响。在一定范围内,随着料液比的增大丁香提取物的抑菌圈直径明显增大。在料液比为1∶20时,抑菌圈直径达到最大值1.328cm,超过该比值抑菌圈直径下降。因此,将正交实验料液比梯度设为1∶15、1∶20、1∶25。
图4 不同料液比对丁香提取物抑菌效果的影响
在单因素实验的基础上,对乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间进行了4因素3水平正交实验,结果如表2和表3所示。
由表2的极差分析结果可知,各因素对丁香抑菌圈直径的影响次序为:乙醇浓度>时间>料液比>温度。由表3的方差分析结果可知,乙醇浓度、料液比及提取时间对抑菌圈直径影响极显著,提取温度对抑菌圈直径影响为显著;其中当乙醇浓度为75%时抑菌效果与80%、85%两个浓度水平相比差异显著,当时间为45、50min两个水平时的抑菌效果与55min时相比差异极显著,而在料液比和温度两个因素各水平之间对抑菌效果影响不显著。从各个角度综合分析,提取条件 A1C1B1D1,即乙醇浓度75%、提取时间45min、料液比1∶15、提取温度40℃为丁香的适宜提取条件。
据报道[9],葡萄采后病原菌中青霉和黑曲霉在无伤接种时不能感染果实。本研究筛选出的致病菌在有伤和无伤接种时均感染果实,其可导致红提葡萄黑点病,该菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、复端孢属。
本研究采用超声波提取法提取丁香抑菌成分,通过对致病菌的抑菌实验,用抑菌圈直径来评定提取效果。通过单因素和正交实验确定丁香抑菌成分的适宜提取条件为:乙醇浓度75%,料液比1∶15,提取时间45min,提取温度40℃。
表2 正交实验结果分析
表3 方差分析结果
[1]牛哲宏,赵炳杰,金川,等.葡萄大批量贮藏保鲜途径与方法[J].北方园艺,1991,5(7):19-22.
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Study on screening pathogenic bacterium from Red Globe Variety and the extraction technology of antimicrobial constituents from lilac flower
XIE Mao-lei,ZHANG Zi-de*,MA Jun-lian,ZHAO Cong-zhi,WANG Xia-yi,ZHANG Xiao-na
(College of Food and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China)
Red Globe Variety as material,pathogenic bacterium were screened and purified then the selected main pathogenic bacterium of Red Globe Variety as the purpose bacterium,extraction process of antimicrobial constituents from lilac was studied.The results showed that No.2 strain pathogenic bacteria was identified as Deuteromycotina,Hyphomycetes,Moniliales,Moniliaceae,Cephalothecium and it caused black spot disease of Red Globe Variety.Appropriate extraction conditions were determined as follows:temperature 40℃,time 45min,75%ethanol solution as extracting solvent,the ratio of solid to liquid 1∶15(g/mL).At these conditions,the satisfactory antibacterial effect with the inhibition ring diameters was 1.957cm.
Red Globe Variety;pathogenic bacterium;lilac;antimicrobial constituents;extraction technology
TS201.1
A
1002-0306(2011)04-0152-03
2009-12-18 *通讯联系人
解茂蕾(1983-),女,在读硕士研究生,研究方向:果蔬贮藏与加工。