清半夏炮制过程中化学物质及刺激性变化研究

黄永亮，范灵婧，王双双，孙灵根，吴纯洁

半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternate(Thunb．)Breit．的干燥块茎。具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结之功效［1］。其主要成分有生物碱、谷甾醇葡萄糖苷、胡萝卜苷、草酸钙、半夏蛋白、氨基酸、有机酸、无机元素、半夏胰蛋白酶抑制物、胆碱等［2］。

生半夏毒性较强，临床上一般炮制后使用。将半夏矾制成清半夏可达到降低毒性的目的，即将生半夏经8%白矾溶液浸泡至“口尝微有麻舌感”。本文通过对清半夏炮制过程中物质基础及刺激性变化研究，揭示半夏矾制对其各种化学成分的影响，同时积极探讨以生物评价法代替口尝法确定炮制终点，从而达到保护工作人员，控制批次间稳定性的目的。

1 实验材料

紫外－可见分光光度计(TU－1091，北京普析通用仪器公司)，氨基酸自动分析仪(835－50型，日本日立公司)。

生半夏(购于四川省新荷花饮片有限公司，经成都中医药大学李敏教授鉴定)，10日龄SPF级鸡胚(购于温江正大畜禽有限公司)，台盼蓝(购于上海欧韦达仪器科技有限公司)，磷酸生理盐水溶液(自制)，甲酰胺、白矾、盐酸、氢氧化钠(购于成都科龙仪器化工有限公司)，所用试剂均为分析纯，水为去离子水。

2 实验方法

2.1 供试样品的制备

清半夏的炮制:取大小一致的半夏，室温条件下用8%白矾溶液浸泡，分别于规定时间点取样适量，滤去白矾溶液，60℃烘干，粉碎，过筛，备用。

生半夏及其炮制品混悬液的制备:称取一定量半夏粉末(过200目筛)，加水研磨，分别制成200 mg·50 mL－1、100 mg·50 mL－1浓度的混悬液。

2.2 鸡胚尿囊膜试验［3］

配制含系列浓度台盼蓝的甲酰胺溶液(5×10－7mol·L－1，4×10－7mol·L－1，2.5×10－7mol·L－1，1×10－7mol·L－1，6×10－8mol·L－1)，在 595 nm 波长下测定其吸光度，以吸光度值(A)对台盼蓝的量(X/×10－7mol)作标准曲线。

取10日龄SPF级鸡胚，用手电筒照射确定鸡胚气室并沿气室边缘划出其范围，剥去蛋壳，暴露蛋壳膜，加2～4滴水于蛋壳膜上，小心剥去蛋壳膜，暴露尿囊膜(CAM)。肉眼观察CAM的完整性及有无出血点等变化，如有出血点或CAM破损则剔除，不能用于下一步试验。试验时，先加入适当量磷酸生理盐水(PBS)以缓冲其渗透压，在CAM上放一硅胶环以固定接触面积，将0.3 mL半夏混悬液加入硅胶环内，作用2 min，然后用约20 mL生理盐水轻柔冲洗至CAM表面干净。5 min后，用0.4 mL的0.1%的台盼蓝通过硅胶环作用于CAM 1 min，过量的染料用蒸馏水漂洗至澄清。精确分离环面积内已染色的CAM，用3 mL甲酰胺提取台盼蓝，放置1 h。用紫外－可见分光光度计于595 nm波长下测定其吸光度，并对应标准曲线计算台盼蓝的量。

以不同等级的国际标准刺激物:15%十二烷基磺酸钠(强刺激性)、二甲亚砜(中度刺激性)、丙二醇(弱刺激性)为阳性对照;未处理的CAM的吸收值为空白对照;PBS为溶剂对照。

2.3 氨基酸含量测定

按照中华人民共和国国家标准GB/T18246－2000，采用酸水解法中的常规水解法进行实验测定，检测环境温度:24℃。

2.4 有机酸含量测定

取不同炮制程度的清半夏粉末约5 g，精密称定，置锥形瓶中，加乙醇50 mL，加热回流1 h，同上操作，再重复提取2次，放冷，滤过，合并滤液，蒸干，残渣精密加入氢氧化钠滴定液(0.1 mol·L－1)10 mL，超声处理(功率500 W，频率40 kHz)30 min，转移至50 mL量瓶中，加新沸过的冷水至刻度，摇匀，精密量取25 mL，按照电位滴定法测定，用盐酸滴定液(0.1 mol·L－1)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1 mL氢氧化钠滴定液相当于5.904 mg的琥珀酸(C4H6O4)。

2.5 白矾残留量测定

取不同炮制程度清半夏粉末(过四号筛)约5 g，精密称定，置坩埚中，缓缓炽热，至完全碳化时，逐渐升高温度至450℃，灰化4 h，取出，放冷，在坩埚中小心加入稀盐酸约10 mL，用表面皿覆盖坩埚，置水浴上加热10 min，表面皿用热水5 mL冲洗，洗液并入坩埚中，滤过，用水50 mL分次洗涤坩埚及滤渣，合并滤液及洗液，加0.025%甲基红乙醇溶液1滴，滴加氨试液至溶液显微黄色。加醋酸－醋酸铵缓冲液(pH 6.0)20 mL，精密加乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05 mol·L－1)滴定至溶液自黄色转变为红色，并将滴定液的结果用空白试验校正。每1 mL的乙二胺四醋酸二钠滴定液(0.05 mol·L－1)相当于23.72 mg的含水硫酸铝钾［KAl(SO4)2·12H2O］。

3 实验结果

3.1 鸡胚尿囊膜染色试验

3.1.1 台盼蓝吸收标准曲线

以吸光度值(A)对台盼蓝的量(X/×10－7mol)进行线性回归，得标准曲线方程:A=0.0676X+0.0034(R2=0.995)。证明经甲酰胺溶解的台盼蓝在595 nm处的吸光度与台盼蓝的量具有很好的线性关系。

3.1.2 鸡胚尿囊膜试验评价生半夏及其炮制品的刺激性

试验以国际标准刺激化学物质为阳性对照，另设空白对照，评价生半夏及炮制品的刺激性。

三批鸡胚尿囊膜染色试验结果见表1，刺激性变化趋势图见图1。

试验结果表明浓度为100 mg·50 mL－1的半夏生品混悬液有明显的刺激性，其细胞损伤强度与15%十二烷基磺酸钠(SDS)相当。而清半夏刺激性较生半夏以及国际标准刺激物质中的强刺激性物质15%SDS、中度刺激性物质二甲亚砜弱，但其刺激性强于弱刺激性物质丙二醇。

聚类分析将清半夏炮制过程0～72 h的样品刺激性聚类分析成三类，结果显示0～16 h半夏具有强刺激性作用，聚类中心为12.38;24～40 h半夏刺激性降低，为中度刺激性，聚类中心为10.28;48～72 h半夏刺激性显著降低，为弱刺激性，聚类中心为4.51。

表1 五批清半夏不同炮制时间刺激性

图1 清半夏炮制过程中刺激性变化趋势

3.2 不同炮制时间样品氨基酸含量

分别选取炮制时间为0 h、24 h、32 h和48 h的半夏炮制品，按氨基酸测定法测定17种氨基酸的含量，并得到氨基酸含量变化趋势，结果见表2，变化趋势见图2。

表2 不同炮制时间清半夏各种氨基酸含量

图2 炮制时间对清半夏氨基酸含量的影响

由分析结果可以看出，生半夏总氨基酸含量为4.16%，在清半夏炮制过程中，各种氨基酸含量的变化趋势相似，都是先升高后降低。

3.3 不同炮制时间样品有机酸含量

表3 不同炮制时间清半夏琥珀酸含量

图3 清半夏琥珀酸含量随炮制时间变化趋势

分别选取不同炮制时间的清半夏样品，按有机酸测定方法测定样品中有机酸的含量，含总酸以琥珀酸计，结果见表3，其含量变化趋势见图3。

3.4 不同炮制时间样品白矾含量

分别取不同炮制时间清半夏粉末5 g，精密称定，按照白矾限量测定方法测定，并作出白矾含量随炮制时间变化趋势图。随着炮制时间增加，清半夏中白矾含量逐渐升高。结果见表4，图4。

表4 不同炮制时间清半夏白矾含量

图4 不同炮制时间清半夏白矾含量变化

4 结论与讨论

清半夏的炮制，药典要求浸泡至“口尝微有麻舌感”，以达到降低毒性，减小刺激性的目的。实验证明白矾溶液浸泡能逐渐降低半夏的刺激性，口尝结果表明，浸泡48 h以后可以达到药典规定程度。传统的经验评价用口尝法来判定炮制终点，带有很大的主观性，鸡胚尿囊膜染色试验能客观表征半夏的刺激性强度，通过分析可以确定“口尝微有麻舌感”对应的刺激性强度范围，若将此方法应用于炮制生产，建立生物评价法判定炮制终点，将有望取代传统的人工口尝，提高标准的客观性，保证产品稳定，在生产上有很好的应用前景。

半夏富含17种氨基酸，生半夏中总氨基酸含量为4.16%。氨基酸是半夏的药效物质之一，对评价半夏的质量有重要的参考价值。该实验结果表明，在清半夏炮制过程中，各种氨基酸的含量变化趋势均为先升高后降低。为了减少氨基酸类成分的损失，应控制半夏炮制时间，不可为追求减毒而盲目延长炮制时间。

2010年版药典规定生半夏按干燥品计算，含总酸以琥珀酸计，不得少于0.25%。清半夏含总酸以琥珀酸计，不得少于0.30%。本实验结果表明，半夏炮制过程中有机酸含量呈缓慢下降趋势，炮制48 h样品的有机酸含量为0.35%，与文献报道［4］白矾溶液能增加有机酸含量的结论不一致。由于半夏炮制过程变化复杂而缓慢，应采取多批次测定，以揭示其含量变化的真正规律。

白矾中的铝离子对人体有害，2010年版药典规定了清半夏中白矾限量为10%。由于随着炮制时间延长，白矾含量呈上升趋势，所以应控制合适的炮制时间，以减少清半夏中铝离子的含量，保证用药安全。

［1］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)［S］．北京:中国医药科技出版社，2010:110．

［2］ 杜贵友，方文贤．有毒中药现代研究与合理应用［M］．北京:中国中医药出版社，2000:413．

［3］ 张小琳，吴纯洁，黄永亮．中药半夏的刺激性评价－鸡胚尿囊膜试验［J］．中国科技论文在线，2010:03．

［4］ 张琳，吴皓，朱涛，等．多指标正交试验优化清半夏炮制工艺［J］．中成药，2008，30(5):704．