通脉醒脑滴丸对局灶性脑缺血模型大鼠的保护作用

陈小睿，田会萍，李佳川，孟宪丽

点实验室 中药资源系统研究与开发利用省部共建国家重点实验室培育基地，四川 成都 610075

脑缺血卒中是严重威胁人类生命健康的常见危急重症。以川芎为代表的活血化瘀中药对脑缺血卒中具有独到疗效。现代研究认为川芎嗪、阿魏酸等为川芎治疗心脑血管疾病的主要成分，而针对川芎挥发油应用于脑血管病治疗的研究报道较少。通脉醒脑滴丸是以川芎挥发油为主要组方原料的中药制剂。本文通过观察通脉醒脑滴丸对缺血再灌注大鼠模型的脑保护作用，初步探讨其可能的作用机制，以期为寻找川芎防治脑缺血新的作用部位提供参考。

1 实验材料

1.1 实验药物

通脉醒脑滴丸(10 mg/粒，成都润华药业有限公司，批号:070530);尼莫地平片(20 mg/片，山西亚宝药业集团股份有限公司，批号:070109)

1.2 实验试剂

SOD试剂盒、MDA试剂盒、NO试剂盒、GSH－Px试剂盒和考马斯亮兰试剂盒(南京建成生物工程研究所)，其余试剂均为国产分析纯。

1.3 仪器

722S型分光光度计(上海棱光技术有限公司)、BP221S型电子天平(SARTORIUS)、DHW－600型不锈钢电热恒温水箱(北京国华医疗器械厂)、医用超低温冰箱(日本SANYO)、LD2－5医用离心机(北京医用离心机厂)等。

1.4 动物

SD大鼠，SPF级，体重300±20 g，雌雄各半，由四川省医学科学院实验动物研究所提供(合格证号:SCXK(川)2004－15)

2 实验方法和结果

2.1 动物分组和给药剂量及方法

健康SD大鼠210只，雌雄各半，随机将每批大鼠分为7组:第1组为假手术组;第2组为模型组;第3、4、5、6组分别为通脉醒脑滴丸大鼠1组、2组、3组和4组;第7组为阳性对照尼莫地平组。每组30只，分3批进行实验。第一批用于测定脑组织含水率，第二批用于观察行为学表现和测定脑组织梗死率，第三批用于脑组织匀浆的生化检查，每批每组各10只。

通脉醒脑滴丸各组灌胃给药，每日1次，连续7日。假手术组及模型组给予等容积蒸馏水。第7天给药1 h后，假手术组大鼠仅在麻醉状态下分离右侧颈总动脉，不予阻断血流。阳性组、模型组和各给药组按照下述2.2所示方法建立大鼠右侧大脑中动脉栓塞再灌注模型。再灌注第23 h后给药一次，第24 h颈椎脱位处死动物取脑。

2.2 大鼠线栓法致局灶性脑缺血再灌注模型(MCAO)的制备

参照文献报道［1～3］，第7天给药1 h后，线栓阻断大脑中动脉(MCA)，2 h后拔出线栓实现再灌注。以动物苏醒后出现提尾时左前肢屈曲或前进时左侧划圈征为右侧大脑中动脉阻塞成功标志。

2.3 统计方法

运用SPSS 13.0 For Windows软件提供的非参数检验(Nonparametric Tests)和方差分析(ONE－WAY ANOVA)进行处理。

2.4 大鼠行为学评分的测定

大鼠处死之前，根据《药理实验方法学》第三版记载的评分标准［4］，进行神经功能缺损评分，分数越高，动物行为障碍越严重。实验结果见表1。

表1 通脉醒脑滴丸对线栓法致局灶性脑缺血再灌注大鼠行为学的影响()

表1 通脉醒脑滴丸对线栓法致局灶性脑缺血再灌注大鼠行为学的影响()

注:与模型组比较，＊＊P＜0.01，*P＜0.05

神经行为学评分假手术组 等容积蒸馏水 10组别 剂量(mg·kg－1) 动物数(只)—模型组 等容积蒸馏水 10 7.5±1.6通脉醒脑滴丸大鼠1组 147.70 10 5.1±1.9*通脉醒脑滴丸大鼠2组 73.85 10 5.2±1.9*通脉醒脑滴丸大鼠3组 36.93 10 6.2±2.5通脉醒脑滴丸大鼠4组 18.46 10 6.7±2.2尼莫地平组 10.00 10 4.6±1.9＊＊

由表1可见，通脉醒脑滴丸大鼠1组、2组神经功能缺损有所改善(P＜0.01～0.05)。通脉醒脑滴丸大鼠3组和4组较之模型组，神经功能缺损有改善的趋势，差异无统计学意义。

2.5 脑组织含水率的测定

大鼠颈椎脱位处死。取脑，冲洗并吸干表面水分，电子天平精确称量湿重，入烘箱105℃烘干48 h后取出，经反复称量直至恒重后(每天称一次，直至两次重量变化小于1%)，记录作为组织干重。用干湿重法求得含水率，公式如下:

脑组织含水率(%)=(湿重－干重)/湿重×100%实验结果见表2。

从表2可见，通脉醒脑滴丸大鼠1组、大鼠2组、大鼠3组三个剂量组的脑水肿程度有所降低(P＜0.01～0.05)。

2.6 脑梗死比率的测定

大鼠颈椎脱位处死。取脑，冠状面均匀切成约2 mm的厚脑片，放入1%TTC磷酸缓冲溶液中，水浴锅避光37℃温孵30 min后，取出置于10%甲醛中避光固定24 h，滤纸吸干表面液体，电子天平精密称取总重并记录。眼科镊精确剥离梗死部位，精密称量并记录。脑梗死比率测定采用公式:

脑梗死比率(%)=(梗死部分重量/全脑重量)×100%

实验结果见表3。

表2 通脉醒脑滴丸对线栓法致局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织含水率的影响()

表2 通脉醒脑滴丸对线栓法致局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织含水率的影响()

注:与模型组比较，＊＊P＜0.01，*P＜0.05

组别 剂量(mg·kg－1) 动物数(只) 脑组织含水率(%)假手术组 等容积蒸馏水 10 78.64±1.72＊＊模型组 等容积蒸馏水 10 81.87±0.70通脉醒脑滴丸大鼠1组 147.70 10 79.97±0.94＊＊通脉醒脑滴丸大鼠2组 73.85 10 80.67±0.74*通脉醒脑滴丸大鼠3组 36.93 10 80.81±0.56*通脉醒脑滴丸大鼠4组 18.46 10 80.89±1.64尼莫地平组 10.00 10 79.83±0.76＊＊

表3 对线栓法致局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗死比率的影响()

表3 对线栓法致局灶性脑缺血再灌注大鼠脑梗死比率的影响()

注:与模型组比较，＊＊P＜0.01，*P＜0.05

组别 剂量(mg·kg－1) 动物数(只) 脑梗死比率(%)假手术组 等容积蒸馏水 10—模型组 等容积蒸馏水 10 12.67±1.28通脉醒脑滴丸大鼠1组 147.70 10 8.96±1.36＊＊通脉醒脑滴丸大鼠2组 73.85 10 10.13±1.86＊＊通脉醒脑滴丸大鼠3组 36.93 10 11.16±1.5*通脉醒脑滴丸大鼠4组 18.46 10 11.24±1.42*尼莫地平组 10.00 10 7.56±1.12＊＊

从表3可见，通脉醒脑滴丸各组均能降低大鼠脑梗死比率(P＜0.01～0.05)。

2.7 对线栓法致大鼠脑缺血再灌注模型自由基氧化损伤的影响

各组大鼠再灌注23 h后，给药一次。给药1 h后，即再灌注24 h，股动脉放血处死大鼠。取脑后于冰盘上去除嗅球、小脑及脑干，用生理盐水漂洗，除去血液，滤纸吸干，立即称湿重。按1:9(W/V)加入生理盐水，冰水浴研制10%脑组织匀浆液，4000转/分冷冻离心10 min，取上清液超低温冰箱保存。严格按照试剂盒说明书操作，采用722分光光度计，黄嘌呤氧化酶法550 nm处测定SOD活力、硫代巴比妥酸法532 nm处测定MDA含量、硝酸还原酶法550 nm处测定NO含量、化学发光法412 nm处测定GSH－Px活力、考马斯亮兰法595 nm处测定组织匀浆上清液蛋白含量。实验结果见表4。

表4可见，通脉醒脑滴丸大鼠1组能明显增加SOD和GSH－Px的活性(P＜0.01～0.05)，降低 MDA和NO的含量(P＜0.01～0.05);通脉醒脑滴丸大鼠2组能提高SOD活力，降低MDA的含量(P＜0.05);通脉醒脑滴丸大鼠3组可降低MDA和NO的含量(P＜0.05)。

表4 通脉醒脑滴丸对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织SOD活性、MDA、NO含量、GSH－Px活力的影响(，n=10)

表4 通脉醒脑滴丸对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织SOD活性、MDA、NO含量、GSH－Px活力的影响(，n=10)

注:与模型组比较，＊＊P＜0.01，*P＜0.05

组别 剂量(mg·kg－1) SOD(U·mgprot－1) MDA(nmol·mgprot－1) NO(μmol· gprot－1) GSH－Px(活力单位)假手术组 等容积蒸馏水 108.19±18.40＊＊ 3.16±1.02＊＊ 3.51±0.75＊＊ 106.40±12.14＊＊模型组 等容积蒸馏水 68.03±17.96 4.99±1.33 5.59±1.18 78.79±13.42通脉醒脑滴丸1组 147.70 95.70±18.19＊＊ 3.63±1.11＊＊ 4.42±1.13* 90.71±12.14*通脉醒脑滴丸2 组 73.85 86.37±8.80* 3.97±0.99* 4.81±1.13 87.48±7.46通脉醒脑滴丸3 组 36.93 80.86±11.90 4.01±0.47* 4.60±1.06* 85.29±6.54通脉醒脑滴丸4 组 18.46 81.85±20.40 4.61±1.10 4.73±0.99 86.86±11.31尼莫地平组 10.00 90.26±17.07＊＊ 3.35±0.66＊＊ 4.42±0.60* 91.52±10.86＊＊

3 讨论

中枢神经系统含有丰富的不饱和脂肪酸，较易发生脂质过氧化反应。脑缺血时，自由基生成过多，引发强烈的链式脂质过氧化反应，产生严重的细胞毒性。当再灌注组织重新获得氧的供应，更易诱发“氧爆发”，加重组织损害。

生理条件下人体细胞内存在的自由基清除剂包括超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH－Px)等，反映了机体清除自由基的能力。丙二醛(MDA)为脂质过氧化产物，常可以反映机体内脂质过氧化的程度。

NO具有神经毒性，是谷氨酸兴奋毒性的主要介质，还可通过过氧化亚硝基阴离子(ONOO—)使线粒体内锰超氧化物歧化酶(Mn－SOD)失活，或再分解为具有更强神经毒性的羟基及二氧化氮(NO2—)自由基［5］，加重缺血再灌注损伤［6］。

研究认为［7］，大量自由基可以使血清内的脂质过氧化物含量明显增加，导致血粘度升高，血小板聚集性增强，易于形成血栓，造成脉道失利，血行障碍。许多活血化瘀中药如川芎、丹参、三七等被认为是有效的天然自由基清除剂，可通过抑制自由基的生成，直接参与对自由基的清除、调节与自由基代谢相关的酶类来减轻自由基氧化损伤。

本实验结果显示，以川芎挥发油为主要组方原料的通脉醒脑滴丸，能改善脑缺血后的组织损伤，减轻脑水肿，改善动物的神经功能症状，其机制与川芎挥发油降低缺血再灌注大鼠的脑组织MDA和NO的含量，升高SOD和GSH－Px的活性，改善自由基防御系统，减少脂质过氧化反应相关。本实验的结果，也为川芎挥发油制剂临床用于缺血性脑血管病的防治提供了药理学依据。

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